طريقة برادفورد: ما هي وكيف تعمل

البروتينات هي جزيئات كبيرة تتكون من الأحماض الأمينية. تم وصف حوالي 500 من الأحماض الأمينية المختلفة في الطبيعة ، ولكن الغريب أن 20 منها فقط هي الأحماض الأساسية الموجودة في جسم الإنسان. يحتوي الحمض النووي على جميع المعلومات اللازمة لتصنيع البروتين ، منذ ذلك الحين آليات النسخ والترجمة ، يتم تحويل ثلاثة توائم من نيوكليوتيدات الحمض النووي إلى حمض أميني أسمنت.

الريبوسومات هي العضيات المسؤولة عن تجميع هذه الأحماض الأمينية ، مما يؤدي إلى ظهور سلاسل ذات أوامر وأطوال متغيرة ، أو ما هو نفسه ، ما نعرفه بالبروتينات. هذه الجزيئات الحيوية ضرورية لتكوين الحياة ، لأنها تمثل حوالي 80٪ من البروتوبلازم الجاف في كل خلية وتمثل 50٪ من الوزن في جميع الأنسجة الحية.

بوجود هذه البيانات في متناول اليد ، أصبح من الواضح لنا أهمية البروتينات في تكوين الحياة. اليوم نأتي إليك بآلية مثيرة للاهتمام للغاية تتعلق بهذا الموضوع ، لأننا سنخبرك بكل شيء عنه طريقة برادفورد، المصممة لقياس تركيز البروتين في المحلول.

• مقالات لها صلة: "ما هي الطريقة العلمية وكيف تعمل؟"

ما هي طريقة برادفورد؟

تم وصف طريقة برادفورد (المعروفة باسم مقال برادفورد للبروتين باللغة الإنجليزية) ، كما يوحي اسمها ، من قبل العالم الأمريكي ماريون مكينلي برادفورد ، في عام 1976. بادئ ذي بدء ، من الضروري التأكيد على ذلك

إنها طريقة قياس الطيف ، وهو مصطلح يشمل مجموعة من الإجراءات المختبرية القائمة على تفاعل الإشعاع الكهرومغناطيسي مع مادة تحليلية (مكون الفائدة الذي تريد فصله عن المصفوفة).

بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنها طريقة ذات طبيعة لونية ، أي أن تحصل على نتائج بناءً على الألوان وتركيزها في محلول معين. تم العثور على مفتاح هذه المجموعة الاصطلاحية في صبغة "Coomassie blue" ، حيث أن طريقة برادفورد تحدد التغيرات في امتصاصها وفقًا لمعايير معينة. تظهر هذه الصبغة باللون الأزرق في شكلها الأنيوني ، والأخضر في شكلها المحايد ، والأحمر في شكلها الموجب.

في ظل الظروف الحمضية في المحلول ، يتحول اللون الأزرق Coomassie من الأحمر إلى الأزرق ، وفي هذه العملية ، يرتبط بالبروتينات المراد قياسها. في حالة عدم وجود بروتينات في الوسط المائي ، يظل الخليط بنيًا ، لذلك من السهل جدًا اكتشاف وجود هذه الجزيئات الكبيرة في المقام الأول باستخدام هذه المنهجية.

القواعد الكيميائية لطريقة برادفورد

نحن ندخل في تضاريس أكثر تعقيدًا ، فقد حان الوقت لوصف ما يحدث بين هذه الجزيئات بما يتجاوز التغيرات المباشرة في اللون. عند الانضمام إلى البروتين ، تشكل Coomassie blue في شكلها الموجب والمزدوج البروتوني (الأحمر) رابطة قوية جدًا غير تساهمية مع الجزيء الكبير المذكور.، بواسطة قوى فان دير فال والتفاعلات الكهروستاتيكية.

أثناء تكوين هذا المركب الكيميائي ، تتبرع الصبغة للأجزاء المؤينة من البروتين الإلكترون الحر (تذكر أن الكاتيون = شحنة موجبة ، يفقد الإلكترونات) ، مما يسبب اضطراب حالة البروتين عادي. هذا يفضح بعض المواد التي قد تولد النقابات الموصوفة سابقًا ، والتي لن نتوقف فيها بسبب تعقيدها الكيميائي. باختصار ، ما عليك سوى معرفة ما يلي:

صبغة حمراء (موجبة / غير مرتبطة بالبروتين) صبغة زرقاء (أنيونية / مرتبطة بالبروتين)

وبناءً على هذا الافتراض ، تجدر الإشارة إلى أن تحتوي الصبغة الحمراء على طيف امتصاص يبلغ 465 نانومتر ، وهي قيمة تمثل الإشعاع الكهرومغناطيسي الساقط الذي تمتصه المادة ضمن نطاق من الترددات. في الشكل الأزرق الأنيوني (التفاعل مع البروتينات) ، يحدث تغيير في الامتصاص عند 595 نانومتر. لذلك ، في محلول يخضع لطريقة برادفورد ، تتم القراءات بمقاييس الطيف الضوئي في نطاق 595 نانومتر.

الزيادة في الامتصاص في هذا الطيف تتناسب طرديًا مع عدد الروابط بين الصبغة والبروتينات ، لذا فهي لا تفعل ذلك. تم الكشف فقط عن وجود بروتينات مع تغير اللون ، ولكن من الممكن أيضًا تقدير كمية البروتين الموجودة لكل مليلتر من الوسط سائل. لا يصدق صحيح؟

• قد تكون مهتمًا بـ: "المواد المخبرية: 23 من الأشياء والأدوات الأساسية"

طريقة برادفورد

لتكون قادرًا على تنفيذ هذه المنهجية ، من الضروري وجود مقياس طيف ضوئي ، وهو ليس رخيصًا تمامًا (حوالي 2000 يورو) ، لذلك فهو ليس شيئًا يمكن تشغيله من المنزل. هذه الآلة قادرة على إسقاط شعاع ضوئي أحادي اللون من خلال عينة ، من أجل قياس كمية الضوء التي تمتصها المركبات محل الاهتمام. وبالتالي ، يتلقى الباحث معلومات حول طبيعة الجزيئات في المحلول المعني ، وبالمناسبة ، يمكنه أيضًا حساب تركيز الجزيء المذكور.

علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الكاشف ليس مجرد لون أزرق "خام" كوماسي. يجب إذابة 100 مليغرام من الصبغة في 50 مليلترًا من محلول إيثانول بنسبة 95٪ وإضافة 100 مليلتر من حمض الفوسفوريك بنسبة 85٪. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري تخفيفه إلى لتر بمجرد إذابة الصبغة وترشيح الخليط ، لإحداث الكاشف النهائي المستخدم في الطريقة. لون هذا المحلول بدون وجود بروتينات ، كما قلنا ، يجب أن يكون بنيًا.

بمجرد حصول الباحث على الكاشف ومقياس الطيف الضوئي ، يجب عليه اتباع الخطوات التالية:

• قم بإعداد مقياس الطيف الضوئي وتحقق من تشغيله بشكل صحيح.
• تحضير محلول البروتين لتحليله. من الناحية المثالية ، يجب أن تحتوي هذه العينة على ما بين 5 و 100 ميكروغرام من البروتين لكل 100 ميكرولتر من المحلول الكلي. من الواضح أن التركيز الدقيق غير معروف ، لكنهما يمثلان القيم القصوى والدنيا.
• تحضير المعايير. لن نخوض في خصوصياتهم بسبب المضاعفات الكيميائية التي تنطوي عليها.
• أضف 5 مل من الكاشف إلى المحلول واتركه يحتضن لمدة 5 دقائق.
• قياس امتصاص الخليط على مقياس الطيف الضوئي عند 595 نانومتر.

ستظهر النتائج على شاشة مقياس الطيف الضوئي ، ويجب أن يلاحظها المحترف الذي يجري التحقيق. بمجرد أن يكون لديهم ، من الضروري إنشاء رسم بياني (منحنى معايرة) يواجه قيمتين على محوره: الامتصاص مقابل ميكروجرام من البروتين. من المنحنى الناتج عن القيم ، يمكن استقراءها للحصول على التركيز الدقيق للبروتين في المحلول.

مميزات

طريقة برادفورد سهلة التنفيذ لأي شخص له علاقة بمجال المختبر ، نظرًا لأن كل عالم أحياء وكيميائي واجه مقياس طيف ضوئي خلال سنوات دراسته واحدًا على الأقل زمن. إما لقياس كمية الكلوروفيل في محلول من تكسير الورقة (نموذجي) إلى أشياء أكثر تعقيدًا ، فإن أجهزة قياس الطيف الضوئي منتشرة جدًا في مجالات التعلم.

بالإضافة إلى سهولة استخدامه ، وتجدر الإشارة إلى أن العديد من البروتينات في حالتها الطبيعية لها نطاق امتصاص منخفض للغاية ، عند 280 نانومتر. لا تصل حتى جميع البروتينات إلى هذه القيمة ، لأنه لهذا يجب أن تحتوي على أحماض أمينية محددة (التيروزين ، والفينيل ألانين ، والتربتوفان) ، والتي لا تكون موجودة دائمًا. نظرًا لأن رقم الامتصاص هذا يقع في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، فمن الضروري وجود آلة خاصة لا يتعين على أي شخص معالجتها تقريبًا.

حقا، ما يتم عمله في طريقة برادفورد هو "زيادة" قيمة امتصاص البروتينات عن طريق الارتباط بصبغة. بالإضافة إلى سهولة القراءة في هذه الحالة ، تبتعد البروتينات عن أطياف الامتصاص للجزيئات البيولوجية الأخرى ، والتي يمكن أن تلوث العينة.

سيرة ذاتية

في فصل الكيمياء الصغير هذا ، انغمسنا في واحدة من أبسط وأسهل طرق تقدير كمية البروتين ، بشرط توفر المواد ذات الصلة. على أي حال ، يجب أن نؤكد أنه ، مثل كل شيء في هذه الحياة ، فهو ليس مثاليًا ومعصومًا عن الخطأ أيضًا: من الضروري عادةً إجراء عمليات متعددة. تخفيف العينة للتحليل (القيم الدنيا والقصوى من 0 ميكروغرام / مل إلى 2000 ميكروغرام / مل) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء أثناء العملية.

علاوة على ذلك ، فإن وجود المنظفات والمركبات الأخرى في المحلول يمكن أن يمنع التطوير الصحيح للطريقة. لحسن الحظ ، هناك كواشف أخرى يمكن إضافتها إلى المزيج لحل هذه المشاكل في كثير من الحالات.

المراجع الببليوغرافية:

• كومبتون ، س. J.، & Jones، C. ج. (1985). آلية استجابة الصبغة والتدخل في اختبار بروتين برادفورد. الكيمياء الحيوية التحليلية، 151 (2) ، 369-374.
• Ernst، O.، & Zor، T. (2010). خطية مقايسة بروتين برادفورد. مجلة التجارب المرئية: JoVE ، (38).
• فريدناور ، إس ، آند بيرليت ، هـ. ح. (1989). حساسية وتنوع مقايسة بروتين برادفورد في وجود المنظفات. الكيمياء الحيوية التحليلية، 178 (2) ، 263-268.
• هو ، ف. (2011). فحص بروتين برادفورد. البروتوكول الحيوي ، e45-e45.
• جونز ، سي. جي ، هير ، ج. ، وكومبتون ، س. ج. (1989). قياس البروتين النباتي بمقايسة برادفورد. مجلة البيئة الكيميائية ، 15 (3) ، 979-992.
• لوبيز ، ج. ، إمبريال ، س. ، فالديراما ، آر ، ونافارو ، س. (1993). فحص بروتين برادفورد المحسن لبروتينات الكولاجين. كلينيكا شيميكا أكتا ، 220 (1) ، 91-100.
• زور ، ت. ، وسيلينجر ، ز. (1996). يزيد التحويل الخطي لمقايسة برادفورد البروتين من حساسيته: دراسات نظرية وتجريبية. الكيمياء الحيوية التحليلية، 236 (2) ، 302-308.