Рекомбинантна ДНК: дефиниция и процес

Техниката на Рекомбинантна ДНК (DNAr) е техника, използвана генно инженерство и която се състои в създаването инвитро на изкуствени ДНК молекули, в които е комбиниран генетичен материал от различни видове. Поради тази причина така получените молекули се наричат ​​химерна ДНК или химери.

Тази техника формира основата на биотехнологиите и генното инженерство и има множество приложения, вариращи от земеделие до биомедицина. Например, позволява изследване на експресията на определен ген, получаване на вид растения, показващи устойчивост на определени вредители или получаващи човешки инсулин от източници животни.

В този урок от УЧИТЕЛ ще ви покажем дефиниция на рекомбинантна ДНК, за какво е тя и процесът което се провежда. Ще анализираме всички етапи, за да познавате по-добре тази генетична техника. Започнахме!

Техниката на рекомбинантната ДНК се състои от въвеждане на избрания ген във вектор. Векторът е малка последователност от ДНК което е лесно да се изолира, като например плазмид (Кръгова и екстрахромозомна ДНК, характерна за бактериите и други прокариотни организми).

Векторът, носещ интересуващия ген, се въвежда в клетката гостоприемник, където ще може репликанезависимо от клетъчната ДНК.

За какво е рекомбинантната ДНК?

Използвайки машината на клетката гостоприемник, генът, въведен от вектора, ще бъде експресиран, което води до синтеза на протеина, кодиран от споменатия ген. Освен това, когато носещата клетка се репликира, получените клетки също ще съдържат споменатия ген, като по този начин се създава нова генетично модифицирана клетъчна линия.

Етапите на получаване на рДНК са както следва:

1- Изолиране и пречистване на гена от интерес

В тази първа стъпка целта е да се изолира генът, който ще се рекомбинира (например генът за човешки инсулин или растежен фактор и т.н.)

• Получаване на клетъчна ДНК: За това е необходимо ДНК да освободи ДНК от клетките, които трябва да бъдат разбити чрез клетъчен лизис. Когато клетките се счупят, те освобождават своя генетичен материал (ДНК) заедно с други молекули като протеини или РНК, така че е необходимо да се изолира и пречисти клетъчната ДНК.
• Получаване на изолирания ген: След като клетъчната ДНК се парифицира и концентрира, е необходимо да се изреже ДНК с помощта на рестрикционни ензими (много специфични ензими, способни да нарушат ДНК последователността в определени точки). Действието на подходящи рестрикционни ензими освобождава гена, който може да бъде изолиран посредством техники за центрофугиране или хроматография.

2- Образуване на рекомбинантна ДНК

Векторът е генетичният материал, който включете изолирания ген и го транспортирайте вътре в клетката гостоприемник.
Векторът обикновено е плазмид (кръгова ДНК, типична за прокариотите), вирус или изкуствено създадена хромозома, която трябва да отговаря на следните характеристики:

• Тя трябва да бъде лесна за изолиране и малка по размер.
• Той трябва да съдържа последователности, които се разпознават от факторите за въвеждане на желания ген.
• Той трябва да може да влезе в клетката гостоприемник, за да се репликира вътре в нея независимо от клетъчната ДНК.
• Той трябва да съдържа генетичен маркер, който позволява лесното му идентифициране и изолиране, като ген за устойчивост на антибиотици.

The етапи Има две от тази втора фаза на процеса на рекомбинантна ДНК:

1. Изрежете вектора: Използвайки същите рестрикционни ензими, използвани за получаване на гена, който трябва да се вмъкне, се прави разрез във векторната ДНК, като два края на ДНК остават свободни.
2. Поставете гена: Свободните краища, причинени от действието на рестрикционните ензими, са точката, в която изолираният преди това ген ще бъде вмъкнат в първия етап на изолиране и пречистване на гена. Съединението между вектора и гена (който веднъж въведен във вектора се нарича инсерция), се осъществява чрез действие на ензима лигаза, който катализира ковалентната връзка между вектора и вложката, пораждаща молекулата на Рекомбинантна ДНК.

3- Въвеждане на rDNA в клетката гостоприемник

Тази стъпка може да се направи от различни техники като промяна с физикохимични средства на пропускливостта на клетъчната мембрана на гостоприемника, за да позволи преминаването на рДНК, микроинжектиране на рДНК С помощта на микропипета, въвеждането на рДНК в липозомите, способни да се слеят с клетъчната мембрана, за да освободят съдържанието й в клетъчната цитоплазма Гост.

Клетките гостоприемници трябва да бъдат клетки, които се размножават много бързо, като се използват или бактериални клетки, дрожди или ракови клетки.

4- Култура на клетки гостоприемници

След като rDNA е въведена в клетките гостоприемници, те се култивират чрез предизвикване на тяхното разделяне за получаване на голям брой клетки, съдържащи рДНК. Клетките се отглеждат в чаши на Петри, които позволяват изолирането на колонии. които впоследствие се отглеждат в течна среда, като по този начин се получават голям брой клонинги (генетично идентични клетки ).

5- Откриване и селекция на клетки, съдържащи рекомбинантна ДНК

В този последен етап става въпрос за идентифицират клетки с рДНК. За идентифициране на тези клетки се използват маркери за откриване на наличието на рДНК. Тези Генетичните маркери могат да бъдат разнообразни, пример би бил културата на клетките гостоприемници в присъствието на антибиотик. Когато генът за устойчивост на антибиотици, присъстващ в културата, е бил предварително включен в рДНК.