Rekombinantní DNA: definice a postup

Technika Rekombinantní DNA (DNAr) je technika používaná genetickým inženýrstvím, která spočívá ve vytváření in vitro umělých molekul DNA, ve kterých je kombinován genetický materiál z různých druhů. Z tohoto důvodu se takto získané molekuly nazývají chimérická DNA nebo chiméry.

Tato technika tvoří základ biotechnologie a genetického inženýrství a má mnoho aplikací od zemědělství až po biomedicínu. Například umožňuje studium exprese určitého genu a získání druhů rostliny vykazující odolnost vůči určitým škůdcům nebo získávající lidský inzulín ze zdrojů zvířata.

V této lekci od UČITELE vám ukážeme definice rekombinantní DNA, k čemu slouží a postup který se koná. Budeme analyzovat všechny fáze, abyste lépe poznali tuto genetickou techniku. Začali jsme!

Technika rekombinantní DNA sestává z zavedení vybraného genu do vektoru. Vektor je malá posloupnost DNA které lze snadno izolovat, například a plazmid (Kruhová a extrachromozomální DNA typická pro bakterie a jiné prokaryotické organismy).

Vektor nesoucí požadovaný gen je zaveden do hostitelské buňky, kde bude schopen

replikovatnezávisle na buněčné DNA.

K čemu je rekombinantní DNA?

Pomocí mechanismu hostitelské buňky bude gen zavedený vektorem exprimován, což povede k syntéze proteinu kódovaného uvedeným genem. Kromě toho, když se nosná buňka replikuje, budou výsledné buňky také obsahovat uvedený gen, čímž vytvoří a nová geneticky modifikovaná buněčná linie.

Fáze získávání rDNA jsou následující:

1 - Izolace a čištění požadovaného genu

V tomto prvním kroku je cílem izolovat gen, který má být rekombinován (například gen pro lidský inzulin nebo růstový faktor atd.)

• Získání buněčné DNA: K tomu je nutné, aby DNA uvolňovala DNA z buněk, které musí být rozbity buněčnou lýzou. Když se buňky rozpadnou, uvolní svůj genetický materiál (DNA) spolu s dalšími molekulami, jako jsou proteiny nebo RNA, a proto je nutné izolovat a čistit buněčnou DNA.
• Získání izolovaného genu: Jakmile je buněčná DNA parifikována a koncentrována, je nutné DNA štěpit pomocí restrikčních enzymů (velmi specifické enzymy schopné v určitých bodech rozbít sekvenci DNA). Působení vhodných restrikčních enzymů uvolňuje gen, který lze izolovat pomocí odstřeďovacích nebo chromatografických technik.

2- Tvorba rekombinantní DNA

Vektor je genetický materiál, který začlenit izolovaný gen a transportovat jej uvnitř hostitelské buňky.
Vektorem je obvykle plazmid (kruhová DNA typická pro prokaryoty), virus nebo uměle vytvořený chromozom, který musí splňovat následující vlastnosti:

• Mělo by být snadno izolovatelné a malé velikosti.
• Musí obsahovat sekvence, které jsou rozpoznávány faktory zavedení požadovaného genu.
• Musí být schopen vstoupit do hostitelské buňky a replikovat se v ní nezávisle na buněčné DNA.
• Musí obsahovat genetický marker, který umožňuje jeho snadnou identifikaci a izolaci, například gen rezistence na antibiotika.

The etapy této druhé fáze procesu rekombinantní DNA jsou dvě:

1. Vystřihněte vektor: Za použití stejných restrikčních enzymů, které se používají k získání vloženého genu, se provede vektorová DNA štěpení, přičemž dva konce DNA zůstanou volné.
2. Vložte gen: Volné konce způsobené působením restrikčních enzymů jsou bodem, kde bude dříve izolovaný gen vložen v první fázi izolace a čištění genu. Spojení mezi vektorem a genem (které se jednou zavede do vektoru se nazývá inzert) nastává působením enzymové ligázy, která katalyzuje kovalentní vazbu mezi vektorem a inzertem, což vede k molekule Rekombinantní DNA.

3 - Zavedení rDNA do hostitelské buňky

Tento krok lze provést pomocí různé techniky jako je fyzikálně-chemická změna permeability membrány hostitelské buňky umožňující průchod rDNA, mikroinjekce rDNA Pomocí mikropipety se zavedení rDNA do liposomů schopných fúze s buněčnou membránou uvolnit její obsah do buněčné cytoplazmy Host.

Hostitelské buňky musí být buňky, které se reprodukují velmi rychle, a to buď pomocí bakteriálních buněk, kvasinkových buněk nebo rakovinných buněk.

4 - Kultura hostitelských buněk

Jakmile je rDNA zavedena do hostitelských buněk, jsou tyto jsou kultivovány vyvoláním jejich rozdělení získat velké množství buněk obsahujících rDNA. Buňky se pěstují v Petriho miskách, které umožňují izolaci kolonií. které se následně kultivují v kapalném médiu, čímž se získá velké množství klonů (geneticky identické buňky ).

5- Detekce a selekce buněk obsahujících rekombinantní DNA

V této poslední fázi jde o identifikovat buňky pomocí rDNA. K identifikaci těchto buněk se používají markery k detekci přítomnosti rDNA. Tyto Genetické markery mohou být různorodé, příkladem může být kultivace hostitelských buněk v přítomnosti a antibiotikum. Když byl gen rezistence na antibiotikum přítomný v kultuře dříve začleněn do rDNA.