Rekombinant DNA: definition og proces

Teknikken til Rekombinant DNA (DNAr) er en teknik, der anvendes genteknologi, og som består i at skabe in vitro af kunstige DNA-molekyler, hvor genetisk materiale fra forskellige arter kombineres. Af denne grund kaldes de således opnåede molekyler kimærisk DNA eller kimærer.

Denne teknik danner grundlaget for bioteknologi og genteknologi og har flere anvendelser lige fra landbrug til biomedicin. For eksempel tillader det undersøgelse af ekspressionen af ​​et bestemt gen og opnåelse af arter planter, der viser resistens over for visse skadedyr eller opnår humant insulin fra kilder dyr.

I denne lektion fra en LÆRER skal vi vise dig definition af rekombinant DNA, hvad det er til og processen der holdes. Vi analyserer alle faser, så du ved bedre denne genetiske teknik. Vi startede!

Den rekombinante DNA-teknik består af indføring af det valgte gen i en vektor. En vektor er en lille sekvens af DNA der er let at isolere, såsom en plasmid (Cirkulært og ekstrakromosomalt DNA, der er typisk for bakterier og andre prokaryote organismer).

Vektoren, der bærer genet af interesse, indføres i en værtscelle, hvor den er i stand til replikereuafhængigt af cellulært DNA.

Hvad er rekombinant DNA til?

Ved anvendelse af værtscellens maskiner vil genet introduceret af vektoren blive udtrykt, hvilket fører til syntese af proteinet kodet af genet. Når bærercellen replikerer, vil de resulterende celler endvidere også indeholde genet og derved skabe et ny genetisk modificeret cellelinje.

Stadierne for opnåelse af rDNA er som følger:

1- Isolering og oprensning af genet af interesse

I dette første trin er målet at isolere genet, der skal rekombineres (for eksempel genet for human insulin eller en vækstfaktor osv.)

• Opnåelse af cellulært DNA: Til dette er det nødvendigt for DNA at frigive DNA fra cellerne, som skal brydes ved cellelyse. Når celler går i stykker, frigiver de deres genetiske materiale (DNA) sammen med andre molekyler som proteiner eller RNA, hvorfor det er nødvendigt at isolere og rense det cellulære DNA.
• Opnåelse af det isolerede gen: Når det cellulære DNA er parificeret og koncentreret, er det nødvendigt at skære DNA'et ved hjælp af restriktionsenzymer (meget specifikke enzymer, der er i stand til at bryde DNA-sekvensen på bestemte punkter). Virkningen af ​​egnede restriktionsenzymer frigør genet, der kan isoleres ved hjælp af centrifugerings- eller kromatografiteknikker.

2- Dannelse af rekombinant DNA

Vektoren er det genetiske materiale, der inkorporere det isolerede gen og transportere det inde i værtscellen.
Vektoren er normalt et plasmid (cirkulært DNA, der er typisk for prokaryoter), en virus eller et kunstigt oprettet kromosom, som skal opfylde følgende egenskaber:

• Det skal være let at isolere og være lille i størrelse.
• Den skal indeholde sekvenser, der genkendes af faktorerne for introduktion af det ønskede gen.
• Det skal være i stand til at komme ind i værtscellen for at replikere inde i den uafhængigt af det cellulære DNA.
• Den skal indeholde en genetisk markør, der gør det let at identificere den og isolere den, såsom et antibiotikaresistensgen.

Det niveauer Der er to af denne anden fase af den rekombinante DNA-proces:

1. Skær vektoren: Ved anvendelse af de samme restriktionsenzymer, der bruges til at opnå genet, der skal indsættes, foretages der et snit i vektor-DNA'et, hvilket efterlader to ender af DNA'et frit.
2. Indsæt genet: De frie ender forårsaget af virkningen af ​​restriktionsenzymer er det punkt, hvor det tidligere isolerede gen vil blive indsat i det første trin af isolering og oprensning af genet. Forbindelsen mellem vektoren og genet (som en gang introduceret i vektoren kaldes en indsats) sker ved handling af enzymet ligase, der katalyserer den kovalente binding mellem vektoren og indsatsen, hvilket giver molekylet af Rekombinant DNA.

3- Introduktion af rDNA i værtscellen

Dette trin kan gøres ved forskellige teknikker såsom at ændre ved fysisk-kemiske midler permeabiliteten af ​​værtscellemembranen til at tillade passage af rDNA, mikroinjektion af rDNA Brug af en mikropipette, introduktion af rDNA i liposomer, der er i stand til at smelte med cellemembranen for at frigive dens indhold i cellens cytoplasma Gæst.

Værtscellerne skal være celler, der reproducerer meget hurtigt ved hjælp af enten bakterieceller, gærceller eller kræftceller.

4- Kultur af værtsceller

Når rDNA er blevet introduceret i værtscellerne, disse dyrkes ved at inducere deres splittelse til opnåelse af et stort antal celler indeholdende rDNA. Cellerne dyrkes i petriskåle, der tillader isolering af kolonier. som efterfølgende dyrkes i flydende medier, hvorved der opnås et stort antal kloner (genetisk identiske celler ).

5- Påvisning og udvælgelse af celler indeholdende rekombinant DNA

I denne sidste fase handler det om identificere celler med rDNA. For at identificere disse celler anvendes markører til at detektere tilstedeværelsen af ​​rDNA. Disse Genetiske markører kan være forskellige, et eksempel er værtscellernes kultur i nærværelse af a antibiotikum. Når det antibiotiske resistensgen, der er til stede i kulturen, tidligere er blevet inkorporeret i rDNA.