Ανασυνδυασμένο DNA: ορισμός και διαδικασία

Η τεχνική του Ανασυνδυασμένο DNA (DNAr) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται γενετική μηχανική και συνίσταται στη δημιουργία in vitro τεχνητών μορίων DNA στα οποία συνδυάζεται γενετικό υλικό από διαφορετικά είδη. Για το λόγο αυτό, τα μόρια που λαμβάνονται έτσι ονομάζονται χιμαιρικό DNA ή χιμαιρές.

Αυτή η τεχνική αποτελεί τη βάση της βιοτεχνολογίας και της γενετικής μηχανικής και έχει πολλαπλές εφαρμογές που κυμαίνονται από τη γεωργία έως τη βιοϊατρική. Για παράδειγμα, επιτρέπει τη μελέτη της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου, αποκτώντας είδη φυτά που παρουσιάζουν αντοχή σε ορισμένα παράσιτα ή λαμβάνουν ανθρώπινη ινσουλίνη από πηγές των ζώων.

Σε αυτό το μάθημα από έναν Δάσκαλο θα σας δείξουμε το ορισμός του ανασυνδυασμένου DNA, για τι χρησιμεύει και για τη διαδικασία που πραγματοποιείται. Θα αναλύσουμε όλα τα στάδια, ώστε να γνωρίζετε καλύτερα αυτήν τη γενετική τεχνική. Ξεκινήσαμε!

Η τεχνική ανασυνδυασμένου DNA αποτελείται από εισαγωγή του επιλεγμένου γονιδίου σε έναν φορέα. Ένας φορέας είναι μια μικρή ακολουθία του

DNA που είναι εύκολο να απομονωθεί, όπως ένα πλασμίδιο (Κυκλικό και εξωχρωμοσωμικό DNA τυπικό για βακτήρια και άλλους προκαρυωτικούς οργανισμούς).

Ο φορέας που φέρει το γονίδιο ενδιαφέροντος εισάγεται σε ένα κύτταρο ξενιστή όπου θα είναι σε θέση επαναλαμβάνωανεξάρτητα από το κυτταρικό DNA.

Σε τι χρησιμεύει το ανασυνδυασμένο DNA;

Χρησιμοποιώντας τη μηχανή του κυττάρου ξενιστή, το γονίδιο που εισάγεται από τον φορέα θα εκφραστεί οδηγώντας στη σύνθεση της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το εν λόγω γονίδιο. Επιπλέον, όταν το κύτταρο φορέας αντιγράφει, τα προκύπτοντα κύτταρα θα περιέχουν επίσης το εν λόγω γονίδιο, δημιουργώντας έτσι ένα νέα γενετικά τροποποιημένη κυτταρική σειρά.

Τα στάδια λήψης rDNA είναι τα εξής:

1- Απομόνωση και καθαρισμός του γονιδίου ενδιαφέροντος

Σε αυτό το πρώτο βήμα, ο στόχος είναι να απομονωθεί το γονίδιο που θα ανασυνδυαστεί (για παράδειγμα, το γονίδιο για ανθρώπινη ινσουλίνη ή ένας αυξητικός παράγοντας, κλπ.)

• Λήψη κυτταρικού DNA: Για αυτό, είναι απαραίτητο το DNA να απελευθερώσει το DNA από τα κύτταρα, το οποίο πρέπει να σπάσει με κυτταρική λύση. Όταν τα κύτταρα σπάνε, απελευθερώνουν το γενετικό τους υλικό (DNA) μαζί με άλλα μόρια όπως πρωτεΐνες ή RNA, οπότε είναι απαραίτητο να απομονωθεί και να καθαριστεί το κυτταρικό DNA.
• Λήψη του απομονωμένου γονιδίου: Μόλις το κυτταρικό DNA καθαριστεί και συμπυκνωθεί, είναι απαραίτητο να κοπεί το DNA χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα (πολύ συγκεκριμένα ένζυμα ικανά να σπάσουν την αλληλουχία DNA σε ορισμένα σημεία). Η δράση κατάλληλων περιοριστικών ενζύμων ελευθερώνει το γονίδιο που μπορεί να απομονωθεί με τεχνικές φυγοκέντρησης ή χρωματογραφίας.

2- Σχηματισμός ανασυνδυασμένου DNA

Ο φορέας είναι το γενετικό υλικό που ενσωματώστε το απομονωμένο γονίδιο και μεταφέρετέ το μέσα στο κελί ξενιστή.
Ο φορέας είναι συνήθως ένα πλασμίδιο (κυκλικό DNA τυπικό των προκαρυωτικών), ένας ιός ή ένα τεχνητά δημιουργημένο χρωμόσωμα, το οποίο πρέπει να πληροί τα ακόλουθα χαρακτηριστικά:

• Θα πρέπει να είναι εύκολο να απομονωθεί και να έχει μικρό μέγεθος.
• Πρέπει να περιέχει αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από τους παράγοντες εισαγωγής του επιθυμητού γονιδίου.
• Πρέπει να μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο ξενιστή για να αναπαράγει μέσα του ανεξάρτητα από το κυτταρικό DNA.
• Πρέπει να περιέχει έναν γενετικό δείκτη που του επιτρέπει να αναγνωρίζεται εύκολα και να απομονώνεται, όπως ένα γονίδιο αντοχής στα αντιβιοτικά.

ο στάδια Υπάρχουν δύο από αυτήν τη δεύτερη φάση της διαδικασίας ανασυνδυασμένου DNA:

1. Κόψτε το διάνυσμα: Χρησιμοποιώντας τα ίδια περιοριστικά ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση του γονιδίου που θα εισαχθεί, γίνεται μια τομή στο DNA του φορέα, αφήνοντας τα δύο άκρα του DNA ελεύθερα.
2. Εισαγάγετε το γονίδιο: Τα ελεύθερα άκρα που προκαλούνται από τη δράση των ενζύμων περιορισμού είναι το σημείο όπου το προηγουμένως απομονωμένο γονίδιο θα εισαχθεί στο πρώτο στάδιο απομόνωσης και καθαρισμού του γονιδίου. Η ένωση μεταξύ του φορέα και του γονιδίου (το οποίο κάποτε εισήχθη στον φορέα ονομάζεται ένθετο), συμβαίνει με δράση του ενζύμου λιγάσης που καταλύει τον ομοιοπολικό δεσμό μεταξύ του φορέα και του ενθέτου δημιουργώντας το μόριο του Ανασυνδυασμένο DNA.

3- Εισαγωγή του rDNA στο κύτταρο ξενιστή

Αυτό το βήμα μπορεί να γίνει από διαφορετικές τεχνικές όπως η αλλαγή με φυσικοχημική σημαίνει τη διαπερατότητα της μεμβράνης κυττάρου ξενιστή ώστε να επιτρέπεται η διέλευση του rDNA, η μικροέγχυση του rDNA Χρησιμοποιώντας μικροπιπέτα, η εισαγωγή του rDNA σε λιποσώματα ικανά να συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη για να απελευθερώσουν το περιεχόμενό του στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου Επισκέπτης.

Τα κύτταρα ξενιστές πρέπει να είναι κύτταρα που αναπαράγονται πολύ γρήγορα, χρησιμοποιώντας είτε βακτηριακά κύτταρα, κύτταρα ζυμομύκητα ή καρκινικά κύτταρα.

4- Καλλιέργεια κυττάρων ξενιστών

Μόλις το rDNA εισαχθεί στα κύτταρα ξενιστές, είναι καλλιεργούνται προκαλώντας τη διαίρεσή τους για να ληφθεί ένας μεγάλος αριθμός κυττάρων που περιέχουν το rDNA. Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε τρυβλία Petri που επιτρέπουν την απομόνωση αποικιών. που στη συνέχεια καλλιεργούνται σε υγρά μέσα, λαμβάνοντας έτσι μεγάλο αριθμό κλώνων (γενετικά πανομοιότυπα κύτταρα ).

5- Ανίχνευση και επιλογή κυττάρων που περιέχουν ανασυνδυασμένο DNA

Σε αυτό το τελευταίο στάδιο πρόκειται για ταυτοποίηση κυττάρων με rDNA. Για την ταυτοποίηση αυτών των κυττάρων, χρησιμοποιούνται δείκτες για την ανίχνευση της παρουσίας του rDNA. Αυτά τα Οι γενετικοί δείκτες μπορούν να είναι διαφορετικοί, ένα παράδειγμα θα ήταν η καλλιέργεια των κυττάρων ξενιστών παρουσία α αντιβιοτικό. Όταν το γονίδιο αντοχής στα αντιβιοτικά που υπάρχει στην καλλιέργεια έχει προηγουμένως ενσωματωθεί στο rDNA.