Μέθοδος Bradford: τι είναι και πώς λειτουργεί

Οι πρωτεΐνες είναι μακρομόρια που αποτελούνται από αμινοξέα. Περίπου 500 διαφορετικά αμινοξέα έχουν περιγραφεί στη φύση, αλλά περίεργα, μόνο 20 είναι τα απαραίτητα που υπάρχουν στο ανθρώπινο σώμα. Το DNA περιέχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης από τότε μηχανισμοί μεταγραφής και μετάφρασης, ένα τρίδυμο νουκλεοτιδίων DNA μετατρέπεται σε αμινοξύ σκυρόδεμα.

Τα ριβοσώματα είναι τα οργανίδια που είναι υπεύθυνα για τη συναρμολόγηση αυτών των αμινοξέων, δημιουργώντας αλυσίδες με τάξεις και μεταβλητό μήκος, ή τι είναι το ίδιο, αυτό που γνωρίζουμε ως πρωτεΐνες. Αυτά τα βιομόρια είναι απαραίτητα για τη σύλληψη της ζωής, καθώς αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% του ξηρού πρωτοπλάσματος σε κάθε κύτταρο και αντιπροσωπεύουν το 50% του βάρους σε όλους τους ζωντανούς ιστούς.

Με αυτά τα δεδομένα στο χέρι, είναι κάτι περισσότερο από σαφές για εμάς τη σημασία των πρωτεϊνών στη δημιουργία της ζωής. Σήμερα ερχόμαστε να σας φέρουμε έναν πολύ ενδιαφέρον μηχανισμό που σχετίζεται με αυτό το θέμα, γιατί θα σας πούμε τα πάντα

Η μέθοδος του Μπράντφορντ, σχεδιασμένο για ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης ενός διαλύματος.

• Σχετικό άρθρο: "Ποια είναι η επιστημονική μέθοδος και πώς λειτουργεί;"

Ποια είναι η μέθοδος Bradford;

Η μέθοδος Bradford (γνωστή ως δοκίμιο πρωτεΐνης Bradfords στα Αγγλικά) περιγράφηκε, όπως υποδηλώνει το όνομά της, από τον Αμερικανό επιστήμονα Marion Mckinley Bradford, το 1976. Πρώτα απ 'όλα, είναι απαραίτητο να τονιστεί αυτό Είναι μια φασματομετρική μέθοδος, ένας όρος που περιλαμβάνει ένα σύνολο εργαστηριακών διαδικασιών που βασίζονται στην αλληλεπίδραση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με έναν αναλύτη (το στοιχείο ενδιαφέροντος που θέλετε να διαχωρίσετε από τη μήτρα).

Εκτός από αυτό, πρέπει να σημειωθεί ότι είναι μια μέθοδος χρωματομετρικής φύσης, δηλαδή λαμβάνει αποτελέσματα με βάση τα χρώματα και τη συγκέντρωσή τους σε μια συγκεκριμένη λύση. Το κλειδί για αυτό το ορολογικό συγκρότημα βρίσκεται στη βαφή "Coomassie blue", καθώς η μέθοδος Bradford ποσοτικοποιεί τις αλλαγές στην απορρόφησή του σύμφωνα με ορισμένες παραμέτρους. Αυτή η βαφή εμφανίζεται μπλε στην ανιονική της μορφή, πράσινη στην ουδέτερη μορφή της και κόκκινη στην κατιονική της μορφή.

Υπό όξινες συνθήκες σε διάλυμα, το μπλε Coomassie μετατρέπεται από κόκκινο σε μπλε και, στη διαδικασία, δεσμεύεται στις πρωτεΐνες που πρέπει να ποσοτικοποιηθούν. Εάν δεν υπάρχουν πρωτεΐνες στο υδατικό μέσο, ​​το μείγμα παραμένει καφέ, επομένως είναι πολύ εύκολο να ανιχνευθεί η παρουσία αυτών των μακρομορίων σε πρώτη φάση με αυτήν τη μεθοδολογία.

Οι χημικές βάσεις της μεθόδου Bradford

Μπαίνουμε σε λίγο πιο περίπλοκο έδαφος, καθώς είναι καιρός να περιγράψουμε τι συμβαίνει μεταξύ αυτών των μορίων πέρα ​​από τις άμεσες αλλαγές χρώματος. Κατά την ένωση με την πρωτεΐνη, το Coomassie blue στην κατιονική και διπλή πρωτονιωμένη του μορφή (κόκκινο) σχηματίζει έναν πολύ ισχυρό μη ομοιοπολικό δεσμό με το εν λόγω μακρομόριο., με δυνάμεις van der waals και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις.

Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού αυτού του χημικού συμπλόκου, η βαφή δίδει στα ιονίζοντα μέρη της πρωτεΐνης αυτής ελεύθερο ηλεκτρόνιο (θυμηθείτε ότι το κατιόν = θετικό φορτίο, χάνει ηλεκτρόνια), το οποίο προκαλεί διαταραχή της πρωτεϊνικής κατάστασης κανονικός. Αυτό εκθέτει ορισμένες ουσίες που μπορεί να δημιουργήσουν τις ενώσεις που περιγράφηκαν προηγουμένως, στις οποίες δεν πρόκειται να σταματήσουμε λόγω της χημικής τους πολυπλοκότητας. Συνοπτικά, πρέπει να γνωρίζετε μόνο τα εξής:

Κόκκινη βαφή (κατιονική / δεν συνδέεται με πρωτεΐνη) ≠ Μπλε βαφή (ανιονική / δεσμευμένη σε πρωτεΐνη)

Βάσει αυτής της υπόθεσης, πρέπει να σημειωθεί ότι η κόκκινη βαφή έχει φάσμα απορρόφησης 465 nm, μια τιμή που αντιπροσωπεύει την προσπίπτουσα ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που απορροφά ένα υλικό εντός εύρους συχνοτήτων. Στην ανιονική μπλε μορφή (αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες), μια αλλαγή στην απορρόφηση συμβαίνει στα 595 nm. Επομένως, σε ένα διάλυμα που υπόκειται στη μέθοδο Bradford, οι μετρήσεις γίνονται σε φασματοφωτόμετρα σε μια περιοχή 595 nm.

Η αύξηση της απορρόφησης σε αυτό το φάσμα είναι άμεσα ανάλογη με τον αριθμό των δεσμών μεταξύ της βαφής και των πρωτεϊνών, έτσι δεν Ανιχνεύεται μόνο ότι υπάρχουν πρωτεΐνες με την αλλαγή χρώματος, αλλά είναι επίσης δυνατό να εκτιμηθεί πόση πρωτεΐνη υπάρχει ανά χιλιοστόλιτρο μέσου υγρό. Απίστευτο αλήθεια;

• Μπορεί να σας ενδιαφέρει: "Εργαστηριακό υλικό: 23 βασικά αντικείμενα και όργανα"

Διαδικασία μεθόδου Bradford

Για την εφαρμογή αυτής της μεθοδολογίας, είναι απαραίτητο ένα φασματοφωτόμετρο, το οποίο δεν είναι ακριβώς φθηνό (περίπου 2.000 ευρώ), οπότε δεν είναι κάτι που μπορεί να τρέξει από το σπίτι. Αυτό το μηχάνημα είναι ικανό να προβάλλει μονοχρωματική δέσμη φωτός μέσω δείγματος, προκειμένου να μετρήσει την ποσότητα φωτός που απορροφάται από τις ενώσεις που ενδιαφέρουν. Έτσι, ο ερευνητής λαμβάνει πληροφορίες σχετικά με τη φύση των μορίων στην εν λόγω λύση και, παρεμπιπτόντως, είναι επίσης σε θέση να υπολογίσει τη συγκέντρωση του εν λόγω μορίου.

Επιπλέον, πρέπει να σημειωθεί ότι το αντιδραστήριο δεν είναι μόνο "ακατέργαστο" μπλε Coomassie. 100 χιλιοστόγραμμα της χρωστικής πρέπει να διαλύονται σε 50 χιλιοστόλιτρα διαλύματος αιθανόλης 95% και προστίθενται 100 χιλιοστόλιτρα φωσφορικού οξέος 85%. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να αραιωθεί σε ένα λίτρο μόλις η βαφή διαλυθεί και διηθηθεί το μείγμα, για να προκύψει το οριστικό αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται στη μέθοδο. Το χρώμα αυτού του διαλύματος χωρίς πρωτεΐνες, όπως έχουμε πει, πρέπει να είναι καφετί.

Μόλις ο ερευνητής έχει το αντιδραστήριο και το φασματοφωτόμετρο, πρέπει να ακολουθήσει τα ακόλουθα βήματα:

• Προετοιμάστε το φασματοφωτόμετρο και ελέγξτε τη σωστή λειτουργία του.
• Προετοιμάστε το πρωτεϊνικό διάλυμα που θα αναλυθεί. Στην ιδανική περίπτωση, αυτό το δείγμα πρέπει να περιέχει μεταξύ 5 και 100 μικρογραμμάρια πρωτεΐνης ανά 100 μικρολίτρα ολικού διαλύματος. Είναι προφανές ότι η ακριβής συγκέντρωση δεν είναι γνωστή, αλλά είναι οι μέγιστες και ελάχιστες τιμές.
• Προετοιμάστε πρότυπα. Δεν πρόκειται να εξετάσουμε τις ιδιαιτερότητές τους λόγω της χημικής επιπλοκής που συνεπάγονται.
• Προσθέστε 5 χιλιοστόλιτρα αντιδραστηρίου στο διάλυμα και αφήστε το να επωαστεί για 5 λεπτά.
• Μετρήστε την απορρόφηση του μείγματος στο φασματοφωτόμετρο στα 595 nm.

Τα αποτελέσματα θα εμφανιστούν στην οθόνη του φασματοφωτόμετρου και θα πρέπει να σημειωθούν από τον επαγγελματία που διεξάγει την έρευνα. Μόλις έχουν, είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί ένα γράφημα (καμπύλη βαθμονόμησης) που αντιμετωπίζει δύο τιμές στους άξονες τους: απορρόφηση έναντι μικρογραμμαρίων πρωτεΐνης. Από την καμπύλη που δημιουργείται με τις τιμές, αυτές μπορούν να παρεκταθούν για να ληφθεί η ακριβής συγκέντρωση πρωτεΐνης στο διάλυμα.

Πλεονέκτημα

Η μέθοδος Bradford είναι πολύ εύκολη στην εκτέλεση για οποιονδήποτε σχετίζεται με το εργαστηριακό πεδίο, δεδομένου ότι κάθε βιολόγος και χημικός αντιμετώπισε ένα φασματοφωτόμετρο κατά τη διάρκεια των ετών σπουδών του τουλάχιστον ενός χρόνος. Είτε για τη μέτρηση της ποσότητας χλωροφύλλης σε διάλυμα από τη σύνθλιψη ενός φύλλου (τυπική) σε πολύ πιο περίπλοκα πράγματα, τα φασματοφωτόμετρα είναι πολύ διαδεδομένα στους τομείς της μάθηση.

Εκτός από την ευκολία του, Πρέπει να σημειωθεί ότι πολλές πρωτεΐνες στη φυσική τους κατάσταση έχουν εξαιρετικά χαμηλό εύρος απορρόφησης, στα 280 nm. Ούτε καν όλες οι πρωτεΐνες φτάνουν σε αυτήν την τιμή, γιατί γι 'αυτό πρέπει να έχουν συγκεκριμένα αμινοξέα (τυροσίνη, φαινυλαλανίνη και τρυπτοφάνη), τα οποία δεν είναι πάντα παρόντα. Καθώς αυτό το σχήμα απορρόφησης βρίσκεται στην περιοχή υπεριώδους ακτινοβολίας, ένα ειδικό μηχάνημα που σχεδόν κανείς δεν είναι απαραίτητο για να μπορεί να τα θεραπεύσει.

Πραγματικά, Αυτό που γίνεται με τη μέθοδο Bradford είναι να "αυξηθεί" η τιμή απορρόφησης των πρωτεϊνών δεσμεύοντας σε μια βαφή. Εκτός από την ευκολότερη ανάγνωση σε αυτήν την κατάσταση, οι πρωτεΐνες απομακρύνονται από τα φάσματα απορρόφησης άλλων βιολογικών μορίων, τα οποία θα μπορούσαν να μολύνουν το δείγμα.

ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ

Σε αυτή τη μικρή κατηγορία χημείας, βυθιστήκαμε σε μια από τις απλούστερες και ευκολότερες μεθόδους ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών για την εκτέλεση, υπό την προϋπόθεση ότι το σχετικό υλικό είναι διαθέσιμο. Σε κάθε περίπτωση, πρέπει να τονίσουμε ότι, όπως όλα σε αυτήν τη ζωή, δεν είναι ούτε τέλειο και αλάνθαστο: είναι συνήθως απαραίτητο να γίνουν πολλαπλές αραιώσεις του δείγματος για ανάλυση (ελάχιστες και μέγιστες τιμές από 0 μg / mL έως 2000 μg / mL), οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε σφάλματα κατά τη διάρκεια η διαδικασία.

Επιπλέον, η παρουσία απορρυπαντικών και άλλων ενώσεων στο διάλυμα μπορεί να αποτρέψει τη σωστή ανάπτυξη της μεθόδου. Ευτυχώς, υπάρχουν και άλλα αντιδραστήρια που μπορούν να προστεθούν στο μείγμα για την επίλυση αυτών των προβλημάτων σε πολλές περιπτώσεις.

Βιβλιογραφικές αναφορές:

• Compton, S. J., & Jones, C. ΣΟΛ. (1985). Μηχανισμός απόκρισης χρωμάτων και παρεμβολών στον προσδιορισμό πρωτεΐνης Bradford. Αναλυτική βιοχημεία, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Γραμμικοποίηση της ανάλυσης πρωτεΐνης Bradford. Περιοδικό οπτικοποιημένων πειραμάτων: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, Η. Η. (1989). Ευαισθησία και μεταβλητότητα της ανάλυσης πρωτεΐνης Bradford παρουσία απορρυπαντικών. Αναλυτική βιοχημεία, 178 (2), 263-268.
• Αυτός, F. (2011). Δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford Βιο-πρωτόκολλο, e45-e45.
• Τζόουνς, Γ. G., Hare, J. D., & Compton, S. Ι. (1989). Μέτρηση φυτικών πρωτεϊνών με τον προσδιορισμό Bradford. Περιοδικό χημικής οικολογίας, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Μια βελτιωμένη ανάλυση πρωτεΐνης Bradford για πρωτεΐνες κολλαγόνου. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Η γραμμικοποίηση της ανάλυσης πρωτεΐνης Bradford αυξάνει την ευαισθησία της: θεωρητικές και πειραματικές μελέτες. Αναλυτική βιοχημεία, 236 (2), 302-308.