Rekombinantti-DNA: määritelmä ja prosessi

Tekniikka Rekombinantti-DNA (DNAr) on tekniikka, jota käytetään geenitekniikassa ja joka koostuu luomisesta in vitro keinotekoisia DNA-molekyylejä, joissa yhdistetään eri lajien geneettistä materiaalia. Tästä syystä näin saatuja molekyylejä kutsutaan kimeeriseksi DNA: ksi tai kimeereiksi.

Tämä tekniikka muodostaa biotekniikan ja geenitekniikan perustan, ja sillä on useita sovelluksia maataloudesta biolääketieteeseen. Esimerkiksi se mahdollistaa tietyn geenin ilmentymisen tutkimuksen, jolloin saadaan lajeja kasvit, jotka osoittavat vastustuskykyä tietyille tuholaisille tai saavat ihmisinsuliinia lähteistä eläimet.

Tässä OPETTAJAN oppitunnissa näytämme sinulle rekombinantti-DNA: n määritelmä, mihin se on tarkoitettu ja prosessi sitä pidetään. Analysoimme kaikki vaiheet, jotta tiedät paremmin tämän geenitekniikan. Me aloitimme!

Rekombinantti-DNA-tekniikka koostuu tuodaan valittu geeni vektoriin. Vektori on pieni sekvenssi DNA joka on helppo eristää, kuten a plasmidi (Bakteereille ja muille prokaryoottisille organismeille tyypillinen ympyrä- ja ekstrakromosomaalinen DNA).

Kiinnostavaa geeniä kantava vektori viedään isäntäsoluun, missä se pystyy kopioidasolun DNA: sta riippumatta.

Mille yhdistelmä-DNA on tarkoitettu?

Isäntäsolun koneistoa käyttäen vektorin viemä geeni ilmentyy, mikä johtaa mainitun geenin koodaaman proteiinin synteesiin. Lisäksi kun kantaja-solu replikoituu, saadut solut sisältävät myös mainitun geenin, mikä luo siten a uusi geneettisesti muunnettu solulinja.

RDNA: n saamisen vaiheet ovat seuraavat:

1 - Kiinnostuksen kohteena olevan geenin eristäminen ja puhdistus

Tässä ensimmäisessä vaiheessa tavoitteena on eristää yhdistettävä geeni (esimerkiksi ihmisinsuliinin geeni tai kasvutekijä jne.)

• Solun DNA: n saaminen: Tätä varten on välttämätöntä, että DNA vapauttaa DNA: n soluista, mikä on hajotettava solujen hajoamisen avulla. Kun solut hajoavat, ne vapauttavat geneettisen materiaalinsa (DNA: n) yhdessä muiden molekyylien, kuten proteiinien tai RNA: n kanssa, joten solun DNA on tarpeen eristää ja puhdistaa.
• Eristetyn geenin saaminen: Kun solu-DNA on parifioitu ja konsentroitu, on tarpeen leikata DNA käyttämällä restriktioentsyymejä (hyvin spesifisiä entsyymejä, jotka kykenevät rikkomaan DNA-sekvenssin tietyissä kohdissa). Sopivien restriktioentsyymien vaikutus vapauttaa geenin, joka voidaan eristää sentrifugointi- tai kromatografiatekniikoilla.

2- Rekombinantti-DNA: n muodostuminen

Vektori on geneettinen materiaali, joka sisällytä eristetty geeni ja kuljeta se isäntäsolun sisällä.
Vektori on yleensä plasmidi (prokaryooteille tyypillinen pyöreä DNA), virus tai keinotekoisesti luotu kromosomi, jonka on täytettävä seuraavat ominaisuudet:

• Sen tulisi olla helppo eristää ja pienikokoinen.
• Sen on sisällettävä sekvenssejä, jotka tunnistavat halutun geenin tuomisen tekijät.
• Sen on kyettävä pääsemään isäntäsoluun replikoitumaan sen sisällä solun DNA: sta riippumatta.
• Sen on sisällettävä geneettinen markkeri, jonka avulla se voidaan helposti tunnistaa ja eristää, kuten antibioottiresistenssigeeni.

Tasot Rekombinantti-DNA-prosessin tässä toisessa vaiheessa on kaksi:

1. Leikkaa vektori: Käyttäen samoja restriktioentsyymejä, joita käytettiin insertoitavan geenin saamiseksi, tehdään vektori-DNA: n leikkaus, jolloin DNA: n kaksi päätä jätetään vapaaksi.
2. Lisää geeni: Rajoitusentsyymien vaikutuksesta aiheutuvat vapaat päät ovat kohta, johon aiemmin eristetty geeni insertoidaan geenin eristämisen ja puhdistamisen ensimmäisessä vaiheessa. Vektorin ja geenin välinen liitos (jota kerran vektoriin tuodaan kutsutaan insertiksi) tapahtuu toiminnalla - entsyymiligaasi, joka katalysoi vektorin ja insertin välistä kovalenttista sidosta, jolloin syntyy Rekombinantti-DNA.

3- rDNA: n tuonti isäntäsoluun

Tämä vaihe voidaan tehdä erilaisia ​​tekniikoita kuten muuttamalla fysikaalis-kemiallisilla keinoilla isäntäsolukalvon läpäisevyys rDNA: n kulkemisen mahdollistamiseksi, rDNA: n mikroinjektio Käyttämällä mikropipettiä rDNA: n vienti liposomeihin, jotka kykenevät fuusioitumaan solukalvon kanssa vapauttamaan sen sisällön solun sytoplasmaan Vieras.

Isäntäsolujen on oltava soluja, jotka lisääntyvät hyvin nopeasti käyttämällä joko bakteerisoluja, hiivasoluja tai syöpäsoluja.

4- Isäntäsolujen viljely

Kun rDNA on viety isäntäsoluihin, ne ovat viljellään indusoimalla heidän jakautumistaan saada suuri määrä rDNA: ta sisältäviä soluja. Soluja kasvatetaan Petri-maljoissa, jotka mahdollistavat pesäkkeiden eristämisen. joita myöhemmin viljellään nestemäisissä väliaineissa, jolloin saadaan suuri määrä klooneja (geneettisesti identtiset solut ).

5- Rekombinantti-DNA: ta sisältävien solujen havaitseminen ja valinta

Tässä viimeisessä vaiheessa on kyse tunnistaa solut rDNA: lla. Näiden solujen tunnistamiseksi käytetään markkereita rDNA: n läsnäolon havaitsemiseksi. Nämä Geneettiset markkerit voivat olla erilaisia, esimerkki olisi isäntäsolujen viljely a: n läsnä ollessa antibiootti. Kun viljelmässä läsnä oleva antibioottiresistenssigeeni on aiemmin sisällytetty rDNA: han.