ब्रैडफोर्ड विधि: यह क्या है और यह कैसे काम करता है

प्रोटीन मैक्रोमोलेक्यूल्स हैं जो अमीनो एसिड से बने होते हैं। प्रकृति में लगभग 500 विभिन्न अमीनो एसिड का वर्णन किया गया है, लेकिन दिलचस्प बात यह है कि मानव शरीर में केवल 20 ही आवश्यक हैं। डीएनए में प्रोटीन को संश्लेषित करने के लिए आवश्यक सभी जानकारी होती है, क्योंकि प्रतिलेखन और अनुवाद के तंत्र, डीएनए न्यूक्लियोटाइड का एक ट्रिपलेट एक एमिनो एसिड में परिवर्तित हो जाता है ठोस।

राइबोसोम इन अमीनो एसिड को इकट्ठा करने के लिए जिम्मेदार अंग हैं, जो चर क्रम और लंबाई के साथ जंजीरों को जन्म देते हैं, या जो समान है, जिसे हम प्रोटीन के रूप में जानते हैं। ये बायोमोलेक्यूल्स जीवन को गर्भ धारण करने के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि वे प्रत्येक कोशिका में लगभग 80% शुष्क प्रोटोप्लाज्म के लिए खाते हैं और सभी जीवित ऊतकों में 50% वजन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

हाथ में इन आंकड़ों के साथ, यह हमारे लिए जीवन की पीढ़ी में प्रोटीन के महत्व से कहीं अधिक स्पष्ट है। आज हम आपके लिए इसी टॉपिक से जुड़ा एक बहुत ही दिलचस्प मैकेनिज्म लेकर आए हैं, क्योंकि हम आपको इसके बारे में सब कुछ बताएंगे ब्रैडफोर्ड की विधि, एक समाधान के प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया।

• संबंधित लेख: "वैज्ञानिक विधि क्या है और यह कैसे काम करती है?"

ब्रैडफोर्ड विधि क्या है?

ब्रैडफोर्ड विधि (अंग्रेजी में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन निबंध के रूप में जाना जाता है) का वर्णन किया गया था, जैसा कि इसके नाम से पता चलता है, अमेरिकी वैज्ञानिक मैरियन मैकिनले ब्रैडफोर्ड ने 1976 में। सबसे पहले इस बात पर जोर देना जरूरी है कि यह एक स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधि है, एक शब्द जिसमें एक विश्लेषण के साथ विद्युत चुम्बकीय विकिरण की बातचीत के आधार पर प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का एक सेट शामिल है (ब्याज का वह घटक जिसे आप मैट्रिक्स से अलग करना चाहते हैं)।

इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह वर्णमिति प्रकृति की एक विधि है, अर्थात एक विशिष्ट समाधान में रंगों और उनकी एकाग्रता के आधार पर परिणाम प्राप्त करता है. इस शब्दावली समूह की कुंजी "कूमासी ब्लू" डाई में पाई जाती है, क्योंकि ब्रैडफोर्ड विधि कुछ मापदंडों के अनुसार इसके अवशोषण में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करती है। यह डाई अपने आयनिक रूप में नीला, अपने तटस्थ रूप में हरा और अपने धनायन के रूप में लाल दिखाई देता है।

घोल में अम्लीय परिस्थितियों में, Coomassie नीला लाल से नीले रंग में बदल जाता है और इस प्रक्रिया में, मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोटीन से जुड़ जाता है। यदि जलीय माध्यम में कोई प्रोटीन नहीं है, तो मिश्रण भूरा रहता है, इसलिए इस पद्धति के साथ पहली बार में इन मैक्रोमोलेक्यूल्स की उपस्थिति का पता लगाना बहुत आसान है।

ब्रैडफोर्ड पद्धति के रासायनिक आधार

हम थोड़ा और जटिल इलाके में प्रवेश कर रहे हैं, क्योंकि यह वर्णन करने का समय है कि इन अणुओं के बीच प्रत्यक्ष रंग परिवर्तन से परे क्या होता है। प्रोटीन के साथ जुड़ने पर, Coomassie नीला अपने धनायनित और दोहरे प्रोटोनेटेड रूप (लाल) में उक्त मैक्रोमोलेक्यूल के साथ एक बहुत मजबूत गैर-सहसंयोजक बंधन बनाता है।वैन डेर वाल्स बलों और इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा।

इस रासायनिक परिसर के निर्माण के दौरान, डाई प्रोटीन के आयनीकृत भागों को दान करती है मुक्त इलेक्ट्रॉन (याद रखें कि धनायन = धनात्मक आवेश, इलेक्ट्रॉनों को खो देता है), जो प्रोटीन अवस्था के विघटन का कारण बनता है सामान्य। यह कुछ ऐसे पदार्थों को उजागर करता है जो पहले वर्णित संघों को उत्पन्न कर सकते हैं, जिसमें हम उनकी रासायनिक जटिलता के कारण रुकने वाले नहीं हैं। संक्षेप में, आपको केवल निम्नलिखित जानने की आवश्यकता है:

लाल रंग (धनायनित / प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं) नीला रंग (आयनिक / प्रोटीन के लिए बाध्य)

इस आधार के आधार पर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लाल डाई में 465 एनएम का अवशोषण स्पेक्ट्रम होता है, एक मान जो घटना विद्युत चुम्बकीय विकिरण का प्रतिनिधित्व करता है जिसे सामग्री आवृत्तियों की एक श्रृंखला के भीतर अवशोषित करती है. आयनिक नीले रूप (प्रोटीन के साथ बातचीत) में, अवशोषण में परिवर्तन 595 एनएम पर होता है। इस कारण से, ब्रैडफोर्ड विधि के अधीन समाधान में, 595 एनएम की सीमा पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रीडिंग की जाती है।

इस स्पेक्ट्रम में अवशोषण में वृद्धि डाई और प्रोटीन के बीच बंधों की संख्या के सीधे आनुपातिक है, इसलिए यह नहीं है केवल यह पता चला है कि रंग बदलने के साथ प्रोटीन होते हैं, लेकिन यह भी अनुमान लगाया जा सकता है कि प्रति मिलीलीटर माध्यम में कितना प्रोटीन है तरल। अविश्वसनीय सच?

• आप में रुचि हो सकती है: "प्रयोगशाला सामग्री: 23 आवश्यक वस्तुएं और उपकरण"

ब्रैडफोर्ड विधि प्रक्रिया

इस पद्धति को करने के लिए, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आवश्यक है, जो बिल्कुल सस्ता नहीं है (लगभग 2,000 यूरो लगभग), इसलिए यह ऐसा कुछ नहीं है जिसे घर से चलाया जा सकता है. ब्याज के यौगिकों द्वारा अवशोषित प्रकाश की मात्रा को मापने के लिए, यह मशीन एक नमूने के माध्यम से प्रकाश की एक मोनोक्रोमैटिक बीम पेश करने में सक्षम है। इस प्रकार, शोधकर्ता को प्रश्न के समाधान में अणुओं की प्रकृति के बारे में जानकारी प्राप्त होती है और संयोग से, उक्त अणु की एकाग्रता की गणना करने में भी सक्षम होता है।

इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अभिकर्मक सिर्फ "कच्चा" Coomassie नीला नहीं है। १०० मिलीग्राम डाई को ९५% इथेनॉल के घोल के ५० मिलीलीटर और ८५% फॉस्फोरिक एसिड के १०० मिलीलीटर में घोलना चाहिए। इसके अलावा, डाई के घुलने के बाद इसे एक लीटर तक पतला करना और मिश्रण को फ़िल्टर करना आवश्यक है, ताकि विधि में उपयोग किए जाने वाले निश्चित अभिकर्मक को जन्म दिया जा सके। प्रोटीन के बिना इस घोल का रंग, जैसा कि हमने कहा है, भूरा होना चाहिए.

एक बार जब शोधकर्ता के पास अभिकर्मक और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर हो, तो उसे निम्नलिखित चरणों का पालन करना चाहिए:

• स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तैयार करें और इसके सही संचालन की जांच करें।
• विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन समाधान तैयार करें। आदर्श रूप से, इस नमूने में कुल घोल के प्रति 100 माइक्रोलीटर में 5 से 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन होना चाहिए। यह स्पष्ट है कि सटीक एकाग्रता ज्ञात नहीं है, लेकिन वे अधिकतम और न्यूनतम मान हैं।
• मानक तैयार करें। रासायनिक जटिलता के कारण हम उनकी विशेषताओं में नहीं जा रहे हैं।
• घोल में 5 मिलीलीटर अभिकर्मक मिलाएं और इसे 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें।
• स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मिश्रण के अवशोषण को ५९५ एनएम पर मापें ।

परिणाम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की स्क्रीन पर दिखाई देंगे, और उस पेशेवर द्वारा नोट किया जाना चाहिए जो जांच कर रहा है। एक बार उनके पास, एक ग्राफ (अंशांकन वक्र) बनाना आवश्यक है जो उनकी कुल्हाड़ियों पर दो मानों का सामना करता है: प्रोटीन का अवशोषण बनाम माइक्रोग्राम. मूल्यों के साथ उत्पन्न वक्र से, समाधान में प्रोटीन की सटीक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इन्हें एक्सट्रपलेशन किया जा सकता है।

लाभ

ब्रैडफोर्ड विधि प्रयोगशाला क्षेत्र से संबंधित किसी भी व्यक्ति के लिए प्रदर्शन करना बहुत आसान है, चूंकि प्रत्येक जीवविज्ञानी और रसायनज्ञ ने अपने अध्ययन के वर्षों के दौरान कम से कम एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का सामना किया है समय। या तो पत्ती को कुचलने से घोल में क्लोरोफिल की मात्रा को मापने के लिए (विशिष्ट) बहुत अधिक जटिल चीजों के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के क्षेत्र में बहुत व्यापक हैं सीख रहा हूँ।

इसकी सहजता के अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उनकी प्राकृतिक अवस्था में कई प्रोटीनों में 280 एनएम. पर बहुत कम अवशोषण सीमा होती है. सभी प्रोटीन भी इस मूल्य तक नहीं पहुंचते हैं, क्योंकि इसके लिए उनके पास विशिष्ट अमीनो एसिड (टायरोसिन, फेनिलएलनिन और ट्रिप्टोफैन) होना चाहिए, जो हमेशा मौजूद नहीं होते हैं। चूंकि यह अवशोषण का आंकड़ा यूवी रेंज में है, इसलिए एक विशेष मशीन की आवश्यकता होती है जिसका इलाज लगभग किसी को नहीं करना पड़ता है।

सच में, ब्रैडफोर्ड पद्धति में जो किया जाता है वह है डाई से बांधकर प्रोटीन के अवशोषण मूल्य को "बढ़ाना". इस अवस्था में पढ़ने में बहुत आसान होने के अलावा, प्रोटीन अन्य जैविक अणुओं के अवशोषण स्पेक्ट्रा से दूर चले जाते हैं, जो नमूने को दूषित कर सकते हैं।

बायोडाटा

इस छोटे से रसायन विज्ञान वर्ग में, हमने प्रदर्शन करने के लिए सबसे सरल और आसान प्रोटीन मात्रा निर्धारण विधियों में से एक में खुद को विसर्जित कर दिया है, बशर्ते प्रासंगिक सामग्री उपलब्ध हो। किसी भी मामले में, हमें इस बात पर जोर देना चाहिए कि, इस जीवन में हर चीज की तरह, यह भी सही और अचूक नहीं है: आमतौर पर कई बनाना आवश्यक है विश्लेषण के लिए नमूने के कमजोर पड़ने (न्यूनतम और अधिकतम मान 0 माइक्रोग्राम / एमएल से 2000 माइक्रोग्राम / एमएल), जिसके दौरान त्रुटियां हो सकती हैं प्रक्रिया।

इसके अलावा, समाधान में डिटर्जेंट और अन्य यौगिकों की उपस्थिति विधि के सही विकास को रोक सकती है। सौभाग्य से, ऐसे अन्य अभिकर्मक हैं जिन्हें कई मामलों में इन समस्याओं को हल करने के लिए मिश्रण में जोड़ा जा सकता है।

ग्रंथ सूची संदर्भ:

• कॉम्पटन, एस. जे।, और जोन्स, सी। जी (1985). ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख में डाई प्रतिक्रिया और हस्तक्षेप का तंत्र। विश्लेषणात्मक जैव रसायन, 151 (2), 369-374।
• अर्न्स्ट, ओ।, और ज़ोर, टी। (2010). ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का रैखिककरण। विज़ुअलाइज़्ड प्रयोगों का जर्नल: जोवे, (38)।
• फ्रीडेनॉयर, एस।, और बेरलेट, एच। एच (1989). डिटर्जेंट की उपस्थिति में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख की संवेदनशीलता और परिवर्तनशीलता। विश्लेषणात्मक जैव रसायन, 178 (2), 263-268।
• वह, एफ. (2011). ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख। बायो-प्रोटोकॉल, e45-e45.
• जोन्स, सी. जी।, हरे, जे। डी।, और कॉम्पटन, एस। जे। (1989). ब्रैडफोर्ड परख के साथ पादप प्रोटीन को मापना। जर्नल ऑफ केमिकल इकोलॉजी, 15 (3), 979-992।
• लोपेज़, जे।, इंपीरियल, एस।, वाल्डेरामा, आर।, और नवारो, एस। (1993). कोलेजन प्रोटीन के लिए एक बेहतर ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख। क्लिनिका चिमिका एक्टा, २२० (१), ९१-१००।
• ज़ोर, टी।, और सेलिंगर, जेड। (1996). ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के रैखिककरण से इसकी संवेदनशीलता बढ़ जाती है: सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक अध्ययन। विश्लेषणात्मक जैव रसायन, 236 (2), 302-308।