DNA ricombinante: definizione e processo

La tecnica di DNA ricombinante (DNAr) è una tecnica utilizzata dall'ingegneria genetica e che consiste nel creare in vitro di molecole di DNA artificiale in cui si combina materiale genetico di specie diverse. Per questo motivo le molecole così ottenute vengono chiamate DNA chimerico o chimere.

Questa tecnica costituisce la base della biotecnologia e dell'ingegneria genetica e ha molteplici applicazioni che vanno dall'agricoltura alla biomedicina. Ad esempio, consente lo studio dell'espressione di un determinato gene, ottenendo specie piante che mostrano resistenza a determinati parassiti o ottengono insulina umana da fonti animali.

In questa lezione di un INSEGNANTE ti mostreremo il definizione di DNA ricombinante, a cosa serve e il processo che si tiene. Analizzeremo tutte le fasi in modo che tu conosca meglio questa tecnica genetica. Abbiamo iniziato!

La tecnica del DNA ricombinante consiste in introducendo il gene selezionato in un vettore. Un vettore è una piccola sequenza di DNA che è facile da isolare, come a

plasmide (DNA circolare ed extracromosomico tipico di batteri e altri organismi procarioti).

Il vettore che trasporta il gene di interesse viene introdotto in una cellula ospite dove sarà in grado di replicareindipendentemente dal DNA cellulare.

A cosa serve il DNA ricombinante?

Utilizzando il macchinario della cellula ospite, verrà espresso il gene introdotto dal vettore portando alla sintesi della proteina codificata da detto gene. Inoltre, quando la cellula portatrice si replica, le cellule risultanti conterranno anche detto gene, creando così a nuova linea cellulare geneticamente modificata.

Le fasi per ottenere l'rDNA sono le seguenti:

1- Isolamento e purificazione del gene di interesse

In questa prima fase, lo scopo è isolare il gene da ricombinare (ad esempio il gene per l'insulina umana o un fattore di crescita, ecc.)

• Ottenere DNA cellulare: Per questo, è necessario che il DNA rilasci il DNA dalle cellule, che deve essere rotto dalla lisi cellulare. Quando le cellule si rompono, rilasciano il loro materiale genetico (DNA) insieme ad altre molecole come proteine ​​o RNA, quindi è necessario isolare e purificare il DNA cellulare.
• Ottenere il gene isolato: Una volta che il DNA cellulare è stato parificato e concentrato, è necessario tagliare il DNA utilizzando enzimi di restrizione (enzimi molto specifici capaci di rompere la sequenza del DNA in determinati punti). L'azione di opportuni enzimi di restrizione libera il gene che può essere isolato mediante tecniche di centrifugazione o cromatografia.

2- Formazione di DNA ricombinante

Il vettore è il materiale genetico che incorporare il gene isolato e trasportarlo all'interno della cellula ospite.
Il vettore è solitamente un plasmide (DNA circolare tipico dei procarioti), un virus o un cromosoma creato artificialmente, che deve possedere le seguenti caratteristiche:

• Dovrebbe essere facile da isolare e di piccole dimensioni.
• Deve contenere sequenze riconosciute dai fattori di introduzione del gene desiderato.
• Deve essere in grado di entrare nella cellula ospite per replicarsi al suo interno indipendentemente dal DNA cellulare.
• Deve contenere un marcatore genetico che gli permetta di essere facilmente identificato e isolato, come un gene di resistenza agli antibiotici.

Il fasi Ci sono due di questa seconda fase del processo del DNA ricombinante:

1. Taglia il vettore: Utilizzando gli stessi enzimi di restrizione utilizzati per ottenere il gene da inserire, viene praticato un taglio nel DNA vettore, lasciando libere due estremità del DNA.
2. Inserisci il gene: Le estremità libere causate dall'azione degli enzimi di restrizione sono il punto in cui il gene precedentemente isolato verrà inserito nella prima fase di isolamento e purificazione del gene. L'unione tra il vettore e il gene (che una volta introdotto nel vettore si chiama inserto), avviene per azione by dell'enzima ligasi che catalizza il legame covalente tra il vettore e l'inserto dando origine alla molecola di DNA ricombinante.

3- Introduzione di rDNA nella cellula ospite

Questo passaggio può essere fatto da diverse tecniche come alterare con mezzi fisico-chimici la permeabilità della membrana della cellula ospite per consentire il passaggio di rDNA, microiniezione di rDNA Utilizzando una micropipetta, l'introduzione di rDNA in liposomi in grado di fondersi con la membrana cellulare per rilasciare il suo contenuto nel citoplasma della cellula Ospite.

Le cellule ospiti devono essere cellule che si riproducono molto rapidamente, utilizzando cellule batteriche, cellule di lievito o cellule cancerose.

4- Coltura di cellule ospiti

Una volta che l'rDNA è stato introdotto nelle cellule ospiti, queste sono coltivate inducendo la loro divisione per ottenere un gran numero di cellule contenenti l'rDNA. Le cellule vengono coltivate in piastre Petri che consentono l'isolamento delle colonie. che vengono successivamente coltivate in terreno liquido, ottenendo così un gran numero di cloni (cellule geneticamente identiche ).

5- Rilevazione e selezione di cellule contenenti DNA ricombinante

In quest'ultima fase si tratta di identificare le cellule con rDNA. Per identificare queste cellule, vengono utilizzati marcatori per rilevare la presenza di rDNA. Questi I marcatori genetici possono essere diversi, un esempio potrebbe essere la coltura di cellule ospiti in presenza di a antibiotico. Quando il gene della resistenza agli antibiotici presente nella coltura è stato precedentemente incorporato nell'rDNA.