Metodo Bradford: cos'è e come funziona

Le proteine ​​sono macromolecole costituite da amminoacidi. In natura sono stati descritti circa 500 amminoacidi diversi, ma curiosamente solo 20 sono quelli essenziali presenti nel corpo umano. Il DNA contiene tutte le informazioni necessarie per la sintesi di una proteina, poiché attraverso meccanismi di trascrizione e traduzione, una tripletta di nucleotidi del DNA viene convertita in un amminoacido calcestruzzo.

I ribosomi sono gli organelli responsabili dell'assemblaggio di questi amminoacidi, dando origine a catene con ordini e lunghezza variabile, o che è lo stesso, ciò che conosciamo come proteine. Queste biomolecole sono essenziali per concepire la vita, in quanto rappresentano circa l'80% del protoplasma secco in ogni cellula e rappresentano il 50% del peso in tutti i tessuti viventi.

Con questi dati alla mano, ci è più che chiara l'importanza delle proteine ​​nella generazione della vita. Oggi veniamo a portarvi un meccanismo molto interessante relativo a questo argomento, perché vi parleremo di tutto

Il metodo di Bradford, progettato per quantificare la concentrazione proteica di una soluzione.

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Che cos'è il metodo Bradford?

Il metodo Bradford (noto come saggio sulle proteine ​​di Bradford in inglese) è stato descritto, come suggerisce il nome, dalla scienziata americana Marion Mckinley Bradford, nel 1976. Innanzitutto è necessario sottolineare che È un metodo spettrometrico, termine che racchiude un insieme di procedure di laboratorio basate sull'interazione della radiazione elettromagnetica con un analita (il componente di interesse che si desidera separare dalla matrice).

Oltre a ciò, va notato che si tratta di un metodo di natura colorimetrica, cioè che ottiene risultati in base ai colori e alla loro concentrazione in una soluzione specifica. La chiave di questo conglomerato terminologico si trova nel colorante “Coomassie blue”, poiché il metodo Bradford quantifica le variazioni della sua assorbanza secondo determinati parametri. Questo colorante appare blu nella sua forma anionica, verde nella sua forma neutra e rosso nella sua forma cationica.

In condizioni acide in soluzione, il blu di Coomassie vira dal rosso al blu e, nel processo, si lega alle proteine ​​da quantificare. Se non ci sono proteine ​​nel mezzo acquoso, la miscela rimane marrone, quindi è molto facile rilevare la presenza di queste macromolecole in prima istanza con questa metodologia.

Le basi chimiche del metodo Bradford

Stiamo entrando in un terreno un po' più complesso, poiché è tempo di descrivere cosa succede tra queste molecole al di là dei cambiamenti diretti di colore. Quando si unisce alla proteina, il blu di Coomassie nella sua forma cationica e doppia protonata (rosso) forma un legame non covalente molto forte con detta macromolecola., dalle forze di van der Waals e dalle interazioni elettrostatiche.

Durante la formazione di questo complesso chimico, il colorante conferisce alle porzioni ionizzabili della proteina la sua elettrone libero (ricorda che catione = carica positiva, perde elettroni), che provoca l'interruzione dello stato proteico normale. Ciò espone alcune sostanze che possono generare le unioni descritte in precedenza, in cui non ci fermeremo a causa della loro complessità chimica. In sintesi, devi solo sapere quanto segue:

Colorante rosso (cationico/non legato alle proteine) Colorante blu (anionico/legato alle proteine)

Sulla base di questa premessa, va notato che il colorante rosso ha uno spettro di assorbimento di 465 nm, valore che rappresenta la radiazione elettromagnetica incidente che un materiale assorbe all'interno di un intervallo di frequenze. Nella forma anionica blu (che interagisce con le proteine), si verifica un cambiamento nell'assorbimento a 595 nm. Pertanto, in una soluzione sottoposta al metodo Bradford, le letture vengono effettuate in spettrofotometri a un intervallo di 595 nm.

L'aumento dell'assorbanza in questo spettro è direttamente proporzionale al numero di legami tra il colorante e le proteine, quindi non è così Viene rilevato solo che ci sono proteine ​​con il cambiamento di colore, ma è anche possibile stimare quante proteine ​​ci sono per millilitro di terreno liquido. Incredibile vero?

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Procedura del metodo Bradford

Per eseguire questa metodologia è necessario uno spettrofotometro, che non è proprio economico (circa 2.000 euro circa), quindi non è qualcosa che si può eseguire da casa. Questa macchina è in grado di proiettare un fascio di luce monocromatico attraverso un campione, al fine di misurare la quantità di luce che viene assorbita dai composti di interesse. Così, il ricercatore riceve informazioni sulla natura delle molecole nella soluzione in questione e, per inciso, è anche in grado di calcolare la concentrazione di detta molecola.

Inoltre, va notato che il reagente non è solo blu di Coomassie "grezzo". 100 milligrammi del colorante devono essere sciolti in 50 millilitri di una soluzione di etanolo al 95% e aggiunti 100 millilitri di acido fosforico all'85%. Inoltre è necessario diluirlo ad un litro una volta che il colorante si è sciolto e filtrare la miscela, per dare origine al reagente definitivo utilizzato nel metodo. Il colore di questa soluzione senza proteine ​​presenti, come abbiamo detto, dovrebbe essere brunastro.

Una volta che il ricercatore ha il reagente e lo spettrofotometro, deve seguire i seguenti passaggi:

• Preparare lo spettrofotometro e verificarne il corretto funzionamento.
• Preparare la soluzione proteica da analizzare. Idealmente, questo campione dovrebbe contenere tra 5 e 100 microgrammi di proteine ​​per 100 microlitri di soluzione totale. È ovvio che la concentrazione esatta non è nota, ma sono i valori massimo e minimo.
• Preparare gli standard. Non entreremo nelle loro particolarità a causa della complicazione chimica che comportano.
• Aggiungere 5 millilitri di reagente alla soluzione e lasciarla incubare per 5 minuti.
• Misurare l'assorbanza della miscela allo spettrofotometro a 595 nm.

I risultati appariranno sullo schermo dello spettrofotometro e dovrebbero essere annotati dal professionista che sta conducendo la ricerca. Una volta che hanno, è necessario creare un grafico (curva di calibrazione) che affronti due valori sui loro assi: assorbanza vs microgrammi di proteine. Dalla curva generata con i valori, questi possono essere estrapolati per ottenere l'esatta concentrazione di proteine ​​nella soluzione.

Vantaggio

Il metodo Bradford è molto facile da eseguire per chiunque abbia a che fare con il campo di laboratorio, poiché ogni biologo e chimico ha affrontato almeno uno spettrofotometro durante i suoi anni di studio tempo. O per misurare la quantità di clorofilla in una soluzione dalla frantumazione di una foglia (tipico) a cose molto più complesse, gli spettrofotometri sono molto diffusi nei campi di apprendimento.

Oltre alla sua facilità, Va notato che molte proteine ​​nel loro stato naturale hanno un intervallo di assorbimento estremamente basso, a 280 nm. Neanche tutte le proteine ​​raggiungono questo valore, perché per questo devono avere aminoacidi specifici (tirosina, fenilalanina e triptofano), che non sempre sono presenti. Poiché questa cifra di assorbanza è nella gamma UV, è necessaria una macchina speciale che quasi nessuno ha per poterli trattare.

Veramente, ciò che viene fatto nel metodo Bradford è "aumentare" il valore di assorbanza delle proteine ​​legandosi a un colorante. Oltre ad essere molto più facili da leggere in questo stato, le proteine ​​si allontanano dagli spettri di assorbanza di altre molecole biologiche, che potrebbero contaminare il campione.

Curriculum vitae

In questa piccola lezione di chimica, ci siamo immersi in uno dei metodi di quantificazione delle proteine ​​più semplici e facili da eseguire, a condizione che sia disponibile il materiale pertinente. In ogni caso, dobbiamo sottolineare che, come ogni cosa in questa vita, non è nemmeno perfetta e infallibile: di solito è necessario fare più diluizioni del campione per l'analisi (valori minimi e massimi da 0 µg/mL a 2000 µg/mL), che possono portare a errori durante il processo.

Inoltre, la presenza di detergenti e altri composti nella soluzione può impedire il corretto sviluppo del metodo. Fortunatamente, ci sono altri reagenti che possono essere aggiunti alla miscela per risolvere questi problemi in molti casi.

Riferimenti bibliografici:

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