ブラッドフォード法：それは何であり、どのように機能するか

タンパク質はアミノ酸からなる高分子です。 自然界には約500種類のアミノ酸が記載されていますが、不思議なことに、人体に必須のアミノ酸は20種類だけです。 DNAには、タンパク質を合成するために必要なすべての情報が含まれています。 転写と翻訳のメカニズム、DNAヌクレオチドのトリプレットはアミノ酸に変換されます コンクリート。

リボソームは、これらのアミノ酸を組み立てる細胞小器官であり、さまざまな順序と長さの鎖、または同じもの、つまりタンパク質として知られている鎖を生じさせます。 これらの生体分子は、すべての細胞の乾燥原形質の約80％を占め、すべての生体組織の重量の50％を占めるため、生命を想像するために不可欠です。

これらのデータが手元にあれば、生命の生成におけるタンパク質の重要性は私たちにとって明らかです。 今日は、このトピックに関連する非常に興味深いメカニズムを紹介します。 ブラッドフォードの方法、溶液のタンパク質濃度を定量化するように設計されています。

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ブラッドフォード法とは何ですか？

ブラッドフォード法（英語ではブラッドフォードタンパク質エッセイとして知られている）は、その名前が示すように、1976年にアメリカの科学者マリオンマッキンリーブラッドフォードによって説明されました。 まず第一に、それを強調する必要があります これは、電磁放射と分析対象物との相互作用に基づく一連の実験手順を含む用語である分光分析法です。 （マトリックスから分離したい対象のコンポーネント）。

これに加えて、それは測色的性質の方法であることに注意する必要があります。 特定の溶液中の色とその濃度に基づいて結果を取得します. ブラッドフォード法は特定のパラメーターに従って吸光度の変化を定量化するため、この用語の集合体の鍵は「クーマシーブルー」染料にあります。 この染料は、陰イオンの形では青、中性の形では緑、陽イオンの形では赤に見えます。

溶液中の酸性条件下で、クマシーブルーは赤から青に変わり、その過程で、定量されるタンパク質に結合します。 水性媒体にタンパク質がない場合、混合物は茶色のままであるため、この方法論を使用すると、最初にこれらの高分子の存在を非常に簡単に検出できます。

ブラッドフォード法の化学的基盤

直接的な色の変化を超えてこれらの分子間で何が起こるかを説明する時が来たので、もう少し複雑な地形に入ります。

タンパク質と結合すると、カチオン型および二重プロトン化型（赤）のクマシーブルーは、前記高分子と非常に強い非共有結合を形成します。、ファンデルワールス力と静電相互作用による。

この化学複合体の形成中に、色素はタンパク質のイオン化可能な部分にその タンパク質の状態を破壊する自由電子（陽イオン=正電荷、電子を失うことを忘れないでください） 正常。 これにより、前述の結合を生成する可能性のある特定の物質が露出しますが、それらの化学的複雑さのために停止することはありません。 要約すると、あなたは以下を知る必要があるだけです：

赤色色素（カチオン性/タンパク質に結合していない）≠青色色素（アニオン性/タンパク質に結合している）

この前提に基づいて、注意する必要があります 赤い染料の吸収スペクトルは465nmです。これは、材料が周波数範囲内で吸収する入射電磁放射を表す値です。. アニオンブルーの形態（タンパク質と相互作用する）では、吸収の変化が595nmで発生します。 したがって、ブラッドフォード法にかけられた溶液では、595nmの範囲で分光光度計で読み取りが行われます。

このスペクトルの吸光度の増加は、色素とタンパク質間の結合の数に正比例するため、そうではありません。 色が変化したタンパク質が検出されるだけですが、培地1ミリリットルあたりのタンパク質の量を推定することもできます。 液体。 信じられないほど本当ですか？

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ブラッドフォード法の手順

この方法論を実行するには、分光光度計が必要ですが、これは正確に安価ではないため（約2,000ユーロ）、自宅から実行できるものではありません。. このマシンは、対象の化合物によって吸収される光の量を測定するために、サンプルを通して単色の光線を投射することができます。 したがって、研究者は、問題の溶液中の分子の性質に関する情報を受け取り、偶然にも、前記分子の濃度を計算することができます。

さらに、試薬は単なる「生の」クマシーブルーではないことに注意する必要があります。 100ミリグラムの染料を50ミリリットルの95％エタノール溶液に溶解し、100ミリリットルの85％リン酸を添加する必要があります。 さらに、染料が溶解したらそれをリットルに希釈し、混合物をろ過して、この方法で使用される決定的な試薬を生成する必要があります。 私たちが言ったように、タンパク質が存在しないこの溶液の色は茶色がかっているはずです.

研究者が試薬と分光光度計を入手したら、次の手順に従う必要があります。

• 分光光度計を準備し、その正しい動作を確認します。
• 分析するタンパク質溶液を準備します。 理想的には、このサンプルには、総溶液100マイクロリットルあたり5〜100マイクログラムのタンパク質が含まれている必要があります。 正確な濃度がわからないことは明らかですが、それらは最大値と最小値です。
• 標準を準備します。 それらが伴う化学的複雑さのために、我々はそれらの特異性に立ち入るつもりはありません。
• 溶液に5ミリリットルの試薬を加え、5分間インキュベートします。
• 分光光度計で595nmの混合物の吸光度を測定します。

結果は分光光度計の画面に表示され、調査を行っている専門家が注意する必要があります。 彼らが持ったら、 軸上で2つの値に直面するグラフ（検量線）を作成する必要があります：吸光度とタンパク質のマイクログラム. 値で生成された曲線から、これらを外挿して、溶液中のタンパク質の正確な濃度を取得できます。

利点

ブラッドフォード法は、実験室の分野に関係する人にとっては非常に簡単に実行できます。 すべての生物学者と化学者は、彼の長年の研究の間に少なくとも1つは分光光度計に直面しているので 時間。 葉の粉砕からの溶液中のクロロフィルの量を測定するためのいずれか（典型的） はるかに複雑なことに、分光光度計はの分野で非常に普及しています 学習。

その使いやすさに加えて、 自然状態の多くのタンパク質は、280nmで非常に低い吸収範囲を持っていることに注意してください。. すべてのタンパク質でさえこの値に達するわけではありません。これは、特定のアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）が必要であり、常に存在するとは限らないためです。 この吸光度の数値はUV範囲にあるため、ほとんど誰も処理する必要のない特別な機械が必要です。

本当に、 ブラッドフォード法で行われることは、色素に結合することによってタンパク質の吸光度値を「増加」させることです。. この状態で読みやすくなることに加えて、タンパク質は他の生体分子の吸光度スペクトルから離れ、サンプルを汚染する可能性があります。

履歴書

この小さな化学のクラスでは、関連する材料が利用可能であれば、実行するのに最も簡単で簡単なタンパク質定量法の1つに没頭しました。 いずれにせよ、私たちは、この人生のすべてのように、それも完璧で間違いのないものではないことを強調しなければなりません：通常、複数を作る必要があります 分析用のサンプルの希釈（0 µg / mLから2000µg / mLの最小値と最大値）。 プロセス。

さらに、溶液中に界面活性剤やその他の化合物が存在すると、メソッドの正しい開発が妨げられる可能性があります。 幸いなことに、多くの場合、これらの問題を解決するためにミックスに追加できる他の試薬があります。

書誌参照：

• コンプトン、S。 J。、＆ジョーンズ、C。 G。 (1985). ブラッドフォードタンパク質アッセイにおける色素応答と干渉のメカニズム。 分析生化学、151（2）、369-374。
• Ernst、O。、およびZor、T。 (2010). ブラッドフォードタンパク質アッセイの線形化。 視覚化された実験のジャーナル：JoVE、（38）。
• フリーデナウ、S。、およびバーレット、H。 H。 (1989). 界面活性剤の存在下でのブラッドフォードタンパク質アッセイの感度と変動性。 分析生化学、178（2）、263-268。
• 彼、F。 (2011). ブラッドフォードタンパク質アッセイ。 バイオプロトコル、e45-e45。
• ジョーンズ、C。 G.、Hare、J。 D。、＆Compton、S。 J。 (1989). ブラッドフォードアッセイによる植物タンパク質の測定。 化学生態学ジャーナル、15（3）、979-992。
• ロペス、J。、インペリアル、S。、バルデラマ、R。、およびナバロ、S。 (1993). コラーゲンタンパク質の改良されたブラッドフォードタンパク質アッセイ。 Clinica chimica acta、220（1）、91-100。
• Zor、T。、およびSelinger、Z。 (1996). ブラッドフォードタンパク質アッセイの線形化は、その感度を高めます：理論的および実験的研究。 分析生化学、236（2）、302-308。