Rekombinowane DNA: definicja i proces

Technika Rekombinowany DNA (DNAr) jest techniką stosowaną w inżynierii genetycznej, która polega na tworzeniu in vitro sztucznych cząsteczek DNA, w których łączy się materiał genetyczny z różnych gatunków. Z tego powodu tak otrzymane cząsteczki nazywane są chimerycznym DNA lub chimerami.

Technika ta stanowi podstawę biotechnologii i inżynierii genetycznej i ma wiele zastosowań, od rolnictwa po biomedycynę. Na przykład pozwala na badanie ekspresji określonego genu, uzyskanie gatunku rośliny wykazujące odporność na niektóre szkodniki lub pozyskujące insulinę ludzką ze źródeł Zwierząt.

W tej lekcji od NAUCZYCIELA pokażemy Ci definicja rekombinowanego DNA, do czego służy i proces the który jest w posiadaniu. Przeanalizujemy wszystkie etapy, aby lepiej poznać tę technikę genetyczną. Zaczęliśmy!

Technika rekombinacji DNA składa się z wprowadzenie wybranego genu do wektora. Wektor to mała sekwencja DNA łatwy do wyizolowania, taki jak plazmid (Kołowy i pozachromosomalny DNA typowy dla bakterii i innych organizmów prokariotycznych).

Wektor niosący interesujący gen jest wprowadzany do komórki gospodarza, gdzie będzie mógł able replikaniezależnie od DNA komórkowego.

Do czego służy rekombinowane DNA?

Przy użyciu maszynerii komórki gospodarza gen wprowadzony przez wektor będzie ulegał ekspresji, prowadząc do syntezy białka kodowanego przez ten gen. Ponadto, gdy komórka nosicielska replikuje, powstałe komórki będą również zawierać ten gen, tworząc w ten sposób nowa genetycznie zmodyfikowana linia komórkowa.

Etapy pozyskiwania rDNA są następujące:

1- Izolacja i oczyszczanie genu będącego przedmiotem zainteresowania

Na tym pierwszym etapie celem jest wyizolowanie genu, który ma być rekombinowany (na przykład genu ludzkiej insuliny lub czynnika wzrostu itp.)

• Uzyskanie DNA komórkowego: W tym celu konieczne jest, aby DNA uwolniło DNA z komórek, które muszą zostać rozbite przez lizę komórki. Gdy komórki pękają, uwalniają swój materiał genetyczny (DNA) wraz z innymi cząsteczkami, takimi jak białka czy RNA, dlatego konieczne jest wyizolowanie i oczyszczenie DNA komórkowego.
• Uzyskanie wyizolowanego genu: Gdy DNA komórkowe zostanie paryfikowane i skoncentrowane, konieczne jest cięcie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych (bardzo specyficznych enzymów zdolnych do przerwania sekwencji DNA w określonych punktach). Działanie odpowiednich enzymów restrykcyjnych uwalnia gen, który można wyizolować za pomocą technik wirowania lub chromatografii.

2- Tworzenie rekombinowanego DNA

Wektor to materiał genetyczny, który włączyć wyizolowany gen i przetransportować go wewnątrz komórki gospodarza.
Wektorem jest zazwyczaj plazmid (kołowy DNA typowy dla prokariontów), wirus lub sztucznie wytworzony chromosom, który musi spełniać następujące cechy:

• Powinien być łatwy do wyizolowania i mały.
• Musi zawierać sekwencje, które są rozpoznawane przez czynniki wprowadzenia pożądanego genu.
• Musi być w stanie wejść do komórki gospodarza, aby replikować się w niej niezależnie od DNA komórkowego.
• Musi zawierać marker genetyczny umożliwiający łatwą identyfikację i izolację, taki jak gen oporności na antybiotyki.

gradacja Istnieją dwie z tej drugiej fazy procesu rekombinacji DNA:

1. Wytnij wektor: Stosując te same enzymy restrykcyjne, których użyto do uzyskania wstawionego genu, wykonuje się nacięcie w DNA wektora, pozostawiając wolne dwa końce DNA.
2. Wstaw gen: Wolne końce spowodowane działaniem enzymów restrykcyjnych są punktem, w którym wcześniej wyizolowany gen zostanie wstawiony w pierwszym etapie izolacji i oczyszczania genu. Połączenie między wektorem a genem (który raz wprowadzony do wektora nazywa się wstawką) następuje poprzez działanie ligazy enzymatycznej, która katalizuje wiązanie kowalencyjne między wektorem a wstawką dającą początek cząsteczce Rekombinowany DNA.

3- Wprowadzenie rDNA do komórki gospodarza

Ten krok można wykonać przez różne techniki takie jak zmiana za pomocą środków fizykochemicznych przepuszczalności błony komórki gospodarza w celu umożliwienia przejścia rDNA, mikroiniekcja rDNA Za pomocą mikropipety wprowadzenie rDNA do liposomów zdolnych do fuzji z błoną komórkową w celu uwolnienia jego zawartości do cytoplazmy komórki Gość.

Komórki gospodarza muszą być komórkami, które bardzo szybko się rozmnażają, wykorzystując komórki bakteryjne, komórki drożdży lub komórki rakowe.

4- Hodowla komórek gospodarza

Po wprowadzeniu rDNA do komórek gospodarza są one: są kultywowane poprzez wywoływanie ich podziału w celu uzyskania dużej liczby komórek zawierających rDNA. Komórki hoduje się na szalkach Petriego, które umożliwiają izolację kolonii. które są następnie hodowane w płynnych podłożach, uzyskując w ten sposób dużą liczbę klonów (komórki identyczne genetycznie) ).

5- Wykrywanie i selekcja komórek zawierających rekombinowany DNA

Na tym ostatnim etapie chodzi o zidentyfikować komórki za pomocą rDNA. Do identyfikacji tych komórek stosuje się markery do wykrywania obecności rDNA. Te Markery genetyczne mogą być zróżnicowane, przykładem może być hodowla komórek gospodarza w obecności antybiotyk. Gdy gen oporności na antybiotyki obecny w hodowli został wcześniej włączony do rDNA.