Metoda Bradforda: co to jest i jak działa

Białka to makrocząsteczki zbudowane z aminokwasów. Około 500 różnych aminokwasów zostało opisanych w przyrodzie, ale co ciekawe, tylko 20 to niezbędne aminokwasy obecne w ludzkim ciele. DNA zawiera wszystkie informacje niezbędne do syntezy białka, ponieważ poprzez protein mechanizmy transkrypcji i translacji, tryplet nukleotydów DNA jest przekształcany w aminokwas beton.

Rybosomy są organellami odpowiedzialnymi za składanie tych aminokwasów, dając początek łańcuchom o różnej długości i uporządkowaniu, czyli tym, co znamy jako białka. Te biomolekuły są niezbędne do poczęcia życia, ponieważ stanowią około 80% suchej protoplazmy w każdej komórce i stanowią 50% masy wszystkich żywych tkanek.

Mając te dane w ręku, jest dla nas więcej niż jasne, jak ważne są białka w powstawaniu życia. Dziś przychodzimy, aby przedstawić Wam bardzo ciekawy mechanizm związany z tym tematem, bo o wszystkim opowiemy Metoda Bradforda, przeznaczony do ilościowego oznaczania stężenia białka w roztworze.

• Powiązany artykuł: „Co to jest metoda naukowa i jak działa?”

Czym jest metoda Bradforda?

Metoda Bradforda (znana jako Bradfords Protein Essay) została opisana, jak sama nazwa wskazuje, przez amerykańskiego naukowca Marion Mckinley Bradford w 1976 roku. Przede wszystkim należy podkreślić, że Jest to metoda spektrometryczna, termin obejmujący zestaw procedur laboratoryjnych opartych na oddziaływaniu promieniowania elektromagnetycznego z analitem (interesujący składnik, który chcesz oddzielić od macierzy).

Oprócz tego należy zauważyć, że jest to metoda o charakterze kolorymetrycznym, to znaczy, że uzyskuje wyniki na podstawie kolorów i ich stężenia w określonym roztworze. Klucz do tego konglomeratu terminologicznego znajduje się w barwniku „błękit Coomassie”, ponieważ metoda Bradforda określa ilościowo zmiany jego absorbancji według określonych parametrów. Barwnik ten ma kolor niebieski w postaci anionowej, zielony w postaci neutralnej i czerwony w postaci kationowej.

W kwaśnych warunkach w roztworze błękit Coomassie zmienia się z czerwonego na niebieski i w trakcie tego procesu wiąże się z oznaczanymi ilościowo białkami. Jeśli w środowisku wodnym nie ma białek, mieszanina pozostaje brązowa, więc bardzo łatwo jest wykryć obecność tych makrocząsteczek w pierwszej kolejności za pomocą tej metodologii.

Chemiczne podstawy metody Bradforda

Wkraczamy w nieco bardziej złożony teren, ponieważ nadszedł czas, aby opisać, co dzieje się między tymi cząsteczkami poza bezpośrednimi zmianami koloru. Po połączeniu z białkiem błękit Coomassie w swojej kationowej i podwójnie protonowanej postaci (czerwony) tworzy bardzo silne wiązanie niekowalencyjne z tą makrocząsteczką., siłami van der Waalsa i oddziaływaniami elektrostatycznymi.

Podczas tworzenia tego kompleksu chemicznego barwnik nadaje jonizowalnym częściom białka jego wolny elektron (pamiętaj, że kation = ładunek dodatni, traci elektrony), co powoduje zakłócenie stanu białka normalna. Odsłania to pewne substancje, które mogą generować opisane wcześniej związki, w których nie zamierzamy się zatrzymać ze względu na ich chemiczną złożoność. Podsumowując, wystarczy wiedzieć, co następuje:

Czerwony barwnik (kationowy / niezwiązany z białkiem) ≠ Niebieski barwnik (anionowy / związany z białkiem)

W oparciu o tę przesłankę należy zauważyć, że czerwony barwnik ma widmo absorpcji 465 nm, wartość reprezentującą padające promieniowanie elektromagnetyczne, które materiał pochłania w zakresie częstotliwości. W anionowej formie niebieskiej (oddziałującej z białkami) zmiana absorpcji następuje przy 595 nm. Dlatego w roztworze poddanym metodzie Bradforda odczyty dokonywane są w spektrofotometrach w zakresie 595 nm.

Wzrost absorbancji w tym widmie jest wprost proporcjonalny do liczby wiązań między barwnikiem a białkami, a więc nie Wykrywa się tylko, że są białka ze zmianą koloru, ale możliwe jest również oszacowanie, ile białka jest na mililitr pożywki ciekły. Niesamowita prawda?

• Możesz być zainteresowany: „Materiał laboratoryjny: 23 niezbędne przedmioty i instrumenty”

Procedura metodą Bradforda

Aby przeprowadzić tę metodologię, potrzebny jest spektrofotometr, który nie jest do końca tani (około 2000 euro), więc nie jest to coś, co można uruchomić z domu. Ta maszyna jest w stanie rzutować monochromatyczną wiązkę światła przez próbkę w celu zmierzenia ilości światła pochłanianego przez badane związki. W ten sposób badacz otrzymuje informację o naturze molekuł w badanym roztworze i, nawiasem mówiąc, jest również w stanie obliczyć stężenie tej molekuły.

Ponadto należy zauważyć, że odczynnik nie jest tylko „surowym” błękitem Coomassie. 100 miligramów barwnika należy rozpuścić w 50 mililitrach 95% roztworu etanolu i dodać 100 mililitrów 85% kwasu fosforowego. Ponadto konieczne jest rozcieńczenie go do litra po rozpuszczeniu barwnika i przefiltrowaniu mieszaniny, aby uzyskać ostateczny odczynnik stosowany w metodzie. Kolor tego roztworu bez obecnych białek, jak powiedzieliśmy, powinien być brązowawy.

Gdy badacz posiada odczynnik i spektrofotometr, musi wykonać następujące czynności:

• Przygotuj spektrofotometr i sprawdź jego poprawność działania.
• Przygotuj roztwór białka do analizy. Idealnie próbka ta powinna zawierać od 5 do 100 mikrogramów białka na 100 mikrolitrów całkowitego roztworu. Jest oczywiste, że dokładne stężenie nie jest znane, ale są to wartości maksymalne i minimalne.
• Przygotuj standardy. Nie będziemy wchodzić w ich osobliwości ze względu na komplikacje chemiczne, które pociągają za sobą.
• Dodaj 5 mililitrów odczynnika do roztworu i pozostaw do inkubacji przez 5 minut.
• Zmierzyć absorbancję mieszaniny na spektrofotometrze przy 595 nm.

Wyniki pojawią się na ekranie spektrofotometru i powinny zostać odnotowane przez specjalistę prowadzącego badanie. Kiedy już to zrobią, konieczne jest stworzenie wykresu (krzywej kalibracji), który ma dwie wartości na swoich osiach: absorbancja vs mikrogramy białka. Z krzywej wygenerowanej z wartościami można je ekstrapolować w celu uzyskania dokładnego stężenia białka w roztworze.

Korzyść

Metoda Bradforda jest bardzo łatwa do wykonania dla każdego związanego z dziedziną laboratoryjną, ponieważ każdy biolog i chemik spotkał się ze spektrofotometrem podczas swoich lat studiów co najmniej jeden czas. Albo zmierzyć ilość chlorofilu w roztworze po zmiażdżeniu liścia (typowo) do znacznie bardziej skomplikowanych rzeczy, spektrofotometry są bardzo rozpowszechnione w dziedzinie uczenie się.

Oprócz łatwości, Należy zauważyć, że wiele białek w stanie naturalnym ma wyjątkowo niski zakres absorpcji, przy 280 nm. Nie wszystkie białka osiągają tę wartość, ponieważ do tego muszą mieć określone aminokwasy (tyrozyna, fenyloalanina i tryptofan), które nie zawsze są obecne. Ponieważ ta wartość absorbancji mieści się w zakresie UV, potrzebna jest specjalna maszyna, której prawie nikt nie musi ich leczyć.

Naprawdę, w metodzie Bradforda „zwiększa się” wartość absorbancji białek poprzez wiązanie się z barwnikiem. Oprócz tego, że są znacznie łatwiejsze do odczytania w tym stanie, białka oddalają się od widm absorbancji innych cząsteczek biologicznych, które mogłyby zanieczyścić próbkę.

Wznawianie

W tej małej klasie chemii zanurzyliśmy się w jedną z najprostszych i najłatwiejszych do wykonania metod oznaczania ilościowego białek, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni materiał. W każdym razie musimy podkreślić, że jak wszystko w tym życiu, nie jest też doskonałe i nieomylne: zwykle trzeba zrobić wiele rozcieńczenia próbki do analizy (wartości minimalne i maksymalne od 0 µg/ml do 2000 µg/ml), które mogą prowadzić do błędów podczas proces.

Ponadto obecność detergentów i innych związków w roztworze może uniemożliwić prawidłowy rozwój metody. Na szczęście istnieją inne odczynniki, które można dodać do mieszanki, aby w wielu przypadkach rozwiązać te problemy.

Odniesienia bibliograficzne:

• Compton, S. J. i Jones, C. SOL. (1985). Mechanizm odpowiedzi na barwnik i interferencja w teście białkowym Bradforda. Biochemia analityczna, 151 (2), 369-374.
• Ernst O. i Zor T. (2010). Linearyzacja testu białkowego Bradforda. Dziennik wizualizowanych eksperymentów: JoVE, (38).
• Friedenauer S. i Berlet H. H. (1989). Czułość i zmienność testu białkowego Bradforda w obecności detergentów. Biochemia analityczna, 178 (2), 263-268.
• On, F. (2011). Test białka Bradforda. Bioprotokół, e45-e45.
• Jones, C. G., Zając, J. D. i Compton, S. JOT. (1989). Pomiar białka roślinnego za pomocą testu Bradforda. Dziennik ekologii chemicznej, 15 (3), 979-992.
• López J., Imperial S., Valderrama R. i Navarro S. (1993). Ulepszony test białkowy Bradforda dla białek kolagenowych. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. i Selinger, Z. (1996). Linearyzacja testu białkowego Bradford zwiększa jego czułość: badania teoretyczne i eksperymentalne. Biochemia analityczna, 236 (2), 302-308.