DNA recombinante: definição e processo

A técnica de DNA recombinante (DNAr) é uma técnica utilizada na engenharia genética e que consiste em criar em vitro de moléculas artificiais de DNA nas quais o material genético de diferentes espécies é combinado. Por esta razão, as moléculas assim obtidas são denominadas DNA quimérico ou quimeras.

Essa técnica é a base da biotecnologia e da engenharia genética e tem múltiplas aplicações, que vão da agricultura à biomedicina. Por exemplo, permite o estudo da expressão de um determinado gene, obtendo espécies plantas que mostram resistência a certas pragas ou obtendo insulina humana de fontes animais.

Nesta lição de um PROFESSOR, vamos mostrar a você o definição de DNA recombinante, para que serve e o processo que é mantido. Vamos analisar todas as etapas para que você conheça melhor essa técnica genética. Nós começamos!

A técnica de DNA recombinante consiste em introdução do gene selecionado em um vetor. Um vetor é uma pequena sequência de DNA que é fácil de isolar, como um plasmídeo (DNA circular e extracromossômico típico de bactérias e outros organismos procarióticos).

O vetor que carrega o gene de interesse é introduzido em uma célula hospedeira onde será capaz de replicarindependentemente do DNA celular.

Para que serve o DNA recombinante?

Utilizando a maquinaria da célula hospedeira, o gene introduzido pelo vetor será expresso levando à síntese da proteína codificada pelo referido gene. Além disso, quando a célula transportadora se replica, as células resultantes também conterão o referido gene, criando assim um nova linha de células geneticamente modificadas.

As etapas de obtenção de rDNA são as seguintes:

1- Isolamento e purificação do gene de interesse

Nesta primeira etapa, o objetivo é isolar o gene a ser recombinado (por exemplo, o gene da insulina humana ou um fator de crescimento, etc.)

• Obtenção de DNA celular: Para isso, é necessário que o DNA libere o DNA das células, que deve ser quebrado pela lise celular. Quando as células se rompem, elas liberam seu material genético (DNA) junto com outras moléculas como proteínas ou RNA, por isso é necessário isolar e purificar o DNA celular.
• Obtenção do gene isolado: Uma vez que o DNA celular foi parificado e concentrado, é necessário cortar o DNA usando enzimas de restrição (enzimas muito específicas, capazes de quebrar a sequência do DNA em determinados pontos). A ação de enzimas de restrição adequadas liberta o gene que pode ser isolado por meio de técnicas de centrifugação ou cromatografia.

2- Formação de DNA recombinante

O vetor é o material genético que incorporar o gene isolado e transportá-lo dentro da célula hospedeira.
O vetor geralmente é um plasmídeo (DNA circular típico de procariotos), um vírus ou um cromossomo criado artificialmente, que deve atender às seguintes características:

• Deve ser fácil de isolar e de tamanho pequeno.
• Deve conter sequências reconhecidas pelos fatores de introdução do gene desejado.
• Deve ser capaz de entrar na célula hospedeira para se replicar dentro dela independentemente do DNA celular.
• Deve conter um marcador genético que permita sua fácil identificação e isolamento, como um gene de resistência a antibióticos.

As estágios Existem dois desta segunda fase do processo de DNA recombinante:

1. Corte o vetor: Usando as mesmas enzimas de restrição usadas para obter o gene a ser inserido, é feito um corte no DNA do vetor, deixando duas extremidades do DNA livres.
2. Insira o gene: As extremidades livres causadas pela ação de enzimas de restrição são o ponto onde o gene previamente isolado será inserido na primeira etapa de isolamento e purificação do gene. A união entre o vetor e o gene (que uma vez introduzido no vetor é chamada de inserção), ocorre por ação da enzima ligase que catalisa a ligação covalente entre o vetor e a inserção dando origem à molécula de DNA recombinante.

3- Introdução de rDNA na célula hospedeira

Esta etapa pode ser realizada por técnicas diferentes como alterar por meio físico-químico a permeabilidade da membrana da célula hospedeira para permitir a passagem de rDNA, microinjeção de rDNA Usando uma micropipeta, a introdução de rDNA em lipossomas capazes de se fundir com a membrana celular para liberar seu conteúdo no citoplasma da célula Convidado.

As células hospedeiras devem ser células que se reproduzem muito rapidamente, usando células bacterianas, células de levedura ou células cancerosas.

4- Cultura de células hospedeiras

Uma vez que o rDNA foi introduzido nas células hospedeiras, estes são cultivados induzindo sua divisão para obter um grande número de células contendo o rDNA. As células são cultivadas em placas de Petri que permitem o isolamento das colônias. que são posteriormente cultivados em meio líquido, obtendo-se assim um grande número de clones (células geneticamente idênticas ).

5- Detecção e seleção de células contendo DNA recombinante

Nesta última fase trata-se de identificar células com rDNA. Para identificar essas células, marcadores são usados ​​para detectar a presença de rDNA. Esses Os marcadores genéticos podem ser diversos, um exemplo seria a cultura das células hospedeiras na presença de um antibiótico. Quando o gene de resistência a antibióticos presente na cultura foi previamente incorporado ao rDNA.