Método de Bradford: o que é e como funciona

As proteínas são macromoléculas constituídas por aminoácidos. Cerca de 500 aminoácidos diferentes foram descritos na natureza, mas curiosamente, apenas 20 são os essenciais presentes no corpo humano. O DNA contém todas as informações necessárias para que uma proteína seja sintetizada, já que por meio mecanismos de transcrição e tradução, um tripleto de nucleotídeos de DNA é convertido em um aminoácido concreto.

Os ribossomos são as organelas responsáveis ​​pela montagem desses aminoácidos, dando origem a cadeias de ordens e comprimentos variáveis, ou seja, o que chamamos de proteínas. Essas biomoléculas são essenciais para a concepção de vida, pois representam cerca de 80% do protoplasma seco de cada célula e representam 50% do peso em todos os tecidos vivos.

Com esses dados em mãos, fica mais do que claro para nós a importância das proteínas na geração da vida. Hoje viemos trazer para vocês um mecanismo muito interessante relacionado a este assunto, pois vamos contar tudo sobre Método de Bradford, projetado para quantificar a concentração de proteína de uma solução.

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Qual é o método de Bradford?

O método de Bradford (conhecido como ensaio de proteína de Bradfords em inglês) foi descrito, como o nome sugere, pela cientista americana Marion Mckinley Bradford, em 1976. Em primeiro lugar, é necessário enfatizar que É um método espectrométrico, termo que engloba um conjunto de procedimentos laboratoriais baseados na interação da radiação eletromagnética com um analito. (o componente de interesse que você deseja separar da matriz).

Além disso, deve-se destacar que se trata de um método de natureza colorimétrica, ou seja, que obtém resultados com base nas cores e sua concentração em uma solução específica. A chave para este conglomerado terminológico encontra-se no corante “Coomassie blue”, uma vez que o método de Bradford quantifica as mudanças em sua absorbância de acordo com certos parâmetros. Este corante aparece azul em sua forma aniônica, verde em sua forma neutra e vermelho em sua forma catiônica.

Em condições ácidas em solução, o azul de Coomassie muda de vermelho para azul e, no processo, liga-se às proteínas a serem quantificadas. Se não houver proteínas no meio aquoso, a mistura permanece marrom, por isso é muito fácil detectar a presença dessas macromoléculas na primeira instância com esta metodologia.

As bases químicas do método de Bradford

Estamos entrando em um terreno um pouco mais complexo, pois é hora de descrever o que acontece entre essas moléculas além das mudanças diretas de cor. Ao se juntar à proteína, o azul de Coomassie em sua forma catiônica e protonada dupla (vermelho) forma uma ligação não covalente muito forte com a referida macromolécula., por forças de van der waals e interações eletrostáticas.

Durante a formação deste complexo químico, o corante dá às porções ionizáveis ​​da proteína sua elétron livre (lembre-se de que cátion = carga positiva, perde elétrons), o que causa a interrupção do estado da proteína normal. Isso expõe certas substâncias que podem gerar as uniões descritas anteriormente, nas quais não vamos parar devido à sua complexidade química. Em resumo, você só precisa saber o seguinte:

Corante vermelho (catiônico / não ligado à proteína) ≠ Corante azul (aniônico / ligado à proteína)

Com base nessa premissa, deve-se notar que o corante vermelho tem um espectro de absorção de 465 nm, um valor que representa a radiação eletromagnética incidente que um material absorve dentro de uma faixa de frequências. Na forma azul aniônica (interagindo com proteínas), ocorre uma mudança na absorção em 595 nm. Portanto, em uma solução submetida ao método de Bradford, as leituras são feitas em espectrofotômetros na faixa de 595 nm.

O aumento da absorbância neste espectro é diretamente proporcional ao número de ligações entre o corante e as proteínas, então não Detecta-se apenas que existem proteínas com a mudança de cor, mas também é possível estimar quanta proteína existe por mililitro de meio. líquido. Incrível, verdade?

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Procedimento do método de Bradford

Para realizar esta metodologia é necessário um espectrofotómetro, que não é propriamente barato (cerca de 2.000 euros aproximadamente), pelo que não é algo que se possa executar a partir de casa. Esta máquina é capaz de projetar um feixe de luz monocromático através de uma amostra, a fim de medir a quantidade de luz que é absorvida pelos compostos de interesse. Assim, o pesquisador recebe informações sobre a natureza das moléculas da solução em questão e, aliás, também consegue calcular a concentração da referida molécula.

Além disso, deve-se notar que o reagente não é apenas azul de Coomassie "bruto". 100 miligramas do corante devem ser dissolvidos em 50 mililitros de uma solução de etanol a 95% e 100 mililitros de ácido fosfórico a 85% adicionados. Além disso, é necessário diluir para um litro após a dissolução do corante e filtrar a mistura, para dar origem ao reagente definitivo utilizado no método. A cor desta solução sem proteínas presentes, como já dissemos, deve ser acastanhada.

Uma vez que o pesquisador possui o reagente e o espectrofotômetro, ele deve seguir os seguintes passos:

• Prepare o espectrofotômetro e verifique seu correto funcionamento.
• Prepare a solução de proteína a ser analisada. Idealmente, esta amostra deve conter entre 5 e 100 microgramas de proteína por 100 microlitros de solução total. É óbvio que a concentração exata não é conhecida, mas são os valores máximo e mínimo.
• Prepare padrões. Não entraremos em suas particularidades devido à complicação química que acarretam.
• Adicione 5 mililitros de reagente à solução e deixe incubar por 5 minutos.
• Meça a absorbância da mistura no espectrofotômetro a 595 nm.

Os resultados aparecerão na tela do espectrofotômetro e deverão ser anotados pelo profissional que está conduzindo a investigação. Assim que tiverem, é necessário criar um gráfico (curva de calibração) que enfrenta dois valores em seus eixos: absorbância vs microgramas de proteína. A partir da curva gerada com os valores, estes podem ser extrapolados para se obter a concentração exata de proteína na solução.

Vantagem

O método de Bradford é muito fácil de executar para qualquer pessoa relacionada ao campo de laboratório, já que todo biólogo e químico enfrentou um espectrofotômetro durante seus anos de estudo, pelo menos um Tempo. Tanto para medir a quantidade de clorofila em uma solução a partir do esmagamento de uma folha (típico) para coisas muito mais complexas, os espectrofotômetros são muito difundidos nas áreas de Aprendendo.

Além de sua facilidade, Deve-se notar que muitas proteínas em seu estado natural têm uma faixa de absorção extremamente baixa, a 280 nm.. Nem todas as proteínas atingem esse valor, pois para isso devem ter aminoácidos específicos (tirosina, fenilalanina e triptofano), que nem sempre estão presentes. Como esse valor de absorbância está na faixa dos UV, uma máquina especial que quase ninguém possui é necessária para tratá-los.

Mesmo, o que é feito no método de Bradford é "aumentar" o valor de absorbância das proteínas ligando-se a um corante. Além de ser muito mais fácil de ler nesse estado, as proteínas se afastam dos espectros de absorbância de outras moléculas biológicas, que podem contaminar a amostra.

Retomar

Nesta pequena aula de química, mergulhamos em um dos métodos de quantificação de proteínas mais simples e fáceis de realizar, desde que o material relevante esteja disponível. Em todo caso, devemos enfatizar que, como tudo nesta vida, também não é perfeito e infalível: normalmente é necessário fazer múltiplos diluições da amostra para análise (valores mínimo e máximo de 0 µg / mL a 2000 µg / mL), o que pode levar a erros durante o processo.

Além disso, a presença de detergentes e outros compostos na solução pode impedir o correto desenvolvimento do método. Felizmente, existem outros reagentes que podem ser adicionados à mistura para resolver esses problemas em muitos casos.

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