ADN recombinant: definiție și proces

Tehnica de ADN recombinant (DNAr) este o tehnică utilizată ingineria genetică și care constă în crearea in vitro a moleculelor de ADN artificial în care se combină materialul genetic din diferite specii. Din acest motiv, moleculele astfel obținute se numesc ADN himeric sau himere.

Această tehnică constituie baza biotehnologiei și ingineriei genetice și are multiple aplicații, de la agricultură la biomedicină. De exemplu, permite studierea expresiei unei anumite gene, obținând specii plante care prezintă rezistență la anumiți dăunători sau care obțin insulină umană din surse animale.

În această lecție de la un PROFESOR, vă vom arăta definirea ADN-ului recombinant, pentru ce este și procesul care se ține. Vom analiza toate etapele, astfel încât să cunoașteți mai bine această tehnică genetică. Am inceput!

Tehnica ADN-ului recombinant constă din introducerea genei selectate într-un vector. Un vector este o mică secvență de ADN care este ușor de izolat, cum ar fi a plasmidă (ADN circular și extracromozomal tipic pentru bacterii și alte organisme procariote).

Vectorul care poartă gena de interes este introdus într-o celulă gazdă unde va putea replicăindependent de ADN-ul celular.

Pentru ce este ADN-ul recombinant?

Folosind utilajul celulei gazdă, gena introdusă de vector va fi exprimată conducând la sinteza proteinei codificate de gena menționată. Mai mult, atunci când celula purtătoare se reproduce, celulele rezultate vor conține, de asemenea, gena menționată, creând astfel o noua linie celulară modificată genetic.

Etapele obținerii ADNr sunt următoarele:

1- Izolarea și purificarea genei de interes

În acest prim pas, scopul este de a izola gena de recombinat (de exemplu, gena pentru insulina umană sau un factor de creștere etc.)

• Obținerea ADN celular: Pentru aceasta, este necesar ca ADN-ul să elibereze ADN-ul din celule, care trebuie rupt prin liză celulară. Când celulele se rup, își eliberează materialul genetic (ADN) împreună cu alte molecule precum proteine ​​sau ARN, deci este necesar să se izoleze și să se purifice ADN-ul celular.
• Obținerea genei izolate: Odată ce ADN-ul celular a fost parificat și concentrat, este necesar să se taie ADN-ul folosind enzime de restricție (enzime foarte specifice capabile să rupă secvența ADN în anumite puncte). Acțiunea enzimelor de restricție adecvate eliberează gena care poate fi izolată prin tehnici de centrifugare sau cromatografie.

2- Formarea ADN-ului recombinant

Vectorul este materialul genetic care încorporează gena izolată și transportă-o în interiorul celulei gazdă.
Vectorul este de obicei o plasmidă (ADN circular tipic procariotelor), un virus sau un cromozom creat artificial, care trebuie să îndeplinească următoarele caracteristici:

• Ar trebui să fie ușor de izolat și de dimensiuni reduse.
• Trebuie să conțină secvențe care sunt recunoscute de factorii de introducere a genei dorite.
• Trebuie să poată intra în celula gazdă pentru a se replica în interior, independent de ADN-ul celular.
• Trebuie să conțină un marker genetic care să îi permită identificarea și izolarea cu ușurință, cum ar fi o genă de rezistență la antibiotice.

etape Există două din această a doua fază a procesului de ADN recombinant:

1. Tăiați vectorul: Folosind aceleași enzime de restricție folosite pentru a obține gena de inserat, se face o tăietură în ADN-ul vector, lăsând două capete ale ADN-ului liber.
2. Introduceți gena: Capetele libere cauzate de acțiunea enzimelor de restricție sunt punctul în care gena izolată anterior va fi inserată în prima etapă de izolare și purificare a genei. Uniunea dintre vector și genă (care odată introdusă în vector se numește insert), are loc prin acțiune a enzimei ligază care catalizează legătura covalentă între vector și inserție dând naștere moleculei de ADN recombinant.

3- Introducerea ADNr în celula gazdă

Acest pas poate fi realizat de diferite tehnici cum ar fi modificarea fizico-chimică înseamnă permeabilitatea membranei celulei gazdă pentru a permite trecerea rADN, microinjecția rADN Folosind o micropipetă, introducerea de ADNr în lipozomi capabili să fuzioneze cu membrana celulară pentru a elibera conținutul său în citoplasma celulei Oaspete.

Celulele gazdă trebuie să fie celule care se reproduc foarte repede, folosind fie celule bacteriene, celule de drojdie, fie celule canceroase.

4- Cultura celulelor gazdă

Odată ce ADNr a fost introdus în celulele gazdă, acestea sunt cultivate prin inducerea diviziunii lor pentru a obține un număr mare de celule care conțin ADNr. Celulele sunt cultivate în cutii Petri care permit izolarea coloniilor. care sunt ulterior cultivate în mediu lichid, obținându-se astfel un număr mare de clone (celule identice genetic ).

5- Detectarea și selecția celulelor care conțin ADN recombinant

În această ultimă etapă este vorba identifica celulele cu ADNr. Pentru a identifica aceste celule, markerii sunt utilizați pentru a detecta prezența ADNr. Aceste Markerii genetici pot fi diversi, un exemplu ar fi cultura celulelor gazdă în prezența unui antibiotic. Când gena de rezistență la antibiotice prezentă în cultură a fost încorporată anterior în ADNr.