Рекомбинантная ДНК: определение и процесс

Техника Рекомбинантная ДНК (ДНКр) - это метод, используемый генной инженерией и состоящий в создании in vitro искусственных молекул ДНК, в которых объединен генетический материал разных видов. По этой причине полученные таким образом молекулы называют химерными ДНК или химерами.

Этот метод лежит в основе биотехнологии и генной инженерии и имеет множество применений, от сельского хозяйства до биомедицины. Например, он позволяет изучать экспрессию определенного гена, получая вид растения, проявляющие устойчивость к определенным вредителям или получающие человеческий инсулин из источников животные.

В этом уроке от УЧИТЕЛЯ мы покажем вам определение рекомбинантной ДНК, для чего она нужна и процесс что проводится. Мы проанализируем все этапы, чтобы вы лучше знали эту генетическую методику. Мы начали!

Метод рекомбинантной ДНК состоит из введение выбранного гена в вектор. Вектор - это небольшая последовательность ДНК которые легко изолировать, например, плазмида (Круговая и внехромосомная ДНК, типичная для бактерий и других прокариотических организмов).

Вектор, несущий интересующий ген, вводится в клетку-хозяин, где он сможет копироватьнезависимо от клеточной ДНК.

Для чего нужна рекомбинантная ДНК?

Используя механизм клетки-хозяина, ген, введенный вектором, будет экспрессироваться, что приведет к синтезу белка, кодируемого указанным геном. Кроме того, когда клетка-носитель реплицируется, полученные клетки также будут содержать указанный ген, создавая таким образом новая генетически модифицированная клеточная линия.

Этапы получения рДНК следующие:

1- Выделение и очистка интересующего гена

На этом первом этапе цель состоит в том, чтобы выделить ген, который необходимо рекомбинировать (например, ген человеческого инсулина или фактора роста и т. Д.).

• Получение клеточной ДНК: Для этого ДНК необходимо высвободить ДНК из клеток, которая должна быть разрушена путем лизиса клеток. Когда клетки ломаются, они высвобождают свой генетический материал (ДНК) вместе с другими молекулами, такими как белки или РНК, поэтому необходимо выделить и очистить клеточную ДНК.
• Получение изолированного гена: После того, как клеточная ДНК была разделена и сконцентрирована, необходимо разрезать ДНК с помощью рестрикционных ферментов (очень специфических ферментов, способных нарушить последовательность ДНК в определенных точках). Действие подходящих рестрикционных ферментов высвобождает ген, который можно выделить с помощью центрифугирования или хроматографии.

2- Образование рекомбинантной ДНК

Вектор - это генетический материал, который включить изолированный ген и транспортировать его внутри клетки-хозяина.
Вектор обычно представляет собой плазмиду (кольцевую ДНК, типичную для прокариот), вирус или искусственно созданную хромосому, которая должна соответствовать следующим характеристикам:

• Он должен быть легким для изоляции и иметь небольшой размер.
• Он должен содержать последовательности, которые распознаются факторами введения желаемого гена.
• Он должен иметь возможность проникать в клетку-хозяин для репликации внутри нее независимо от клеточной ДНК.
• Он должен содержать генетический маркер, позволяющий легко идентифицировать и изолировать его, например, ген устойчивости к антибиотикам.

В этапы Эта вторая фаза процесса рекомбинантной ДНК состоит из двух этапов:

1. Вырежьте вектор: Используя те же рестрикционные ферменты, которые использовались для получения вставляемого гена, в векторной ДНК делают разрез, оставляя два конца ДНК свободными.
2. Вставьте ген: Свободные концы, вызванные действием рестрикционных ферментов, представляют собой точку, в которую ранее выделенный ген будет вставлен на первом этапе выделения и очистки гена. Объединение между вектором и геном (который, будучи однажды введенным в вектор, называется вставкой), происходит посредством действия фермента лигазы, который катализирует ковалентную связь между вектором и вставкой, дающую начало молекуле Рекомбинантная ДНК.

3- Введение рДНК в клетку-хозяин

Этот шаг может быть выполнен разные техники такие как изменение физико-химическими средствами проницаемости мембраны клетки-хозяина для прохождения рДНК, микроинъекция рДНК Используя микропипетку, введение рДНК в липосомы, способные сливаться с клеточной мембраной, высвобождая ее содержимое в цитоплазму клетки. Гость.

Клетками-хозяевами должны быть клетки, которые очень быстро воспроизводятся с использованием бактериальных клеток, дрожжевых или раковых клеток.

4- Культура клеток-хозяев

Как только рДНК была введена в клетки-хозяева, эти культивируются, вызывая их разделение для получения большого количества клеток, содержащих рДНК. Клетки выращивают в чашках Петри, что позволяет изолировать колонии. которые впоследствии культивируют в жидких средах, получая таким образом большое количество клонов (генетически идентичные клетки ).

5- Обнаружение и отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК

На этом последнем этапе речь идет о идентифицировать клетки с рДНК. Для идентификации этих клеток используются маркеры для обнаружения присутствия рДНК. Эти Генетические маркеры могут быть разнообразными, примером может служить культура клеток-хозяев в присутствии антибиотик. Когда ген устойчивости к антибиотикам, присутствующий в культуре, был ранее включен в рДНК.