Rekombinantna DNA: opredelitev in postopek

Tehnika Rekombinantna DNA (DNAr) je tehnika, ki se uporablja genski inženiring in je sestavljena iz ustvarjanja in vitro umetnih molekul DNA, v katerih je kombiniran genski material različnih vrst. Zaradi tega se tako dobljene molekule imenujejo himerna DNA ali kimere.

Ta tehnika je osnova biotehnologije in genskega inženiringa in ima več aplikacij, od kmetijstva do biomedicine. Na primer, omogoča preučevanje izražanja določenega gena in pridobivanje vrst rastline, ki kažejo odpornost na nekatere škodljivce ali pridobivanje človeškega insulina iz virov živali.

V tej lekciji UČITELJA vam bomo pokazali opredelitev rekombinantne DNA, čemu služi in postopek ki se drži. Analizirali bomo vse stopnje, da boste bolje poznali to gensko tehniko. Začeli smo!

Tehnika rekombinantne DNA je sestavljena iz uvajanje izbranega gena v vektor. Vektor je majhno zaporedje DNK ki ga je enostavno izolirati, na primer a plazmid (Krožna in zunajkromosomska DNA, značilna za bakterije in druge prokariontske organizme).

Vektor, ki nosi gen, ki nas zanima, se vnese v gostiteljsko celico, kjer bo lahko ponoviteneodvisno od celične DNA.

Za kaj je rekombinantna DNA?

Z uporabo mehanizmov gostiteljske celice se bo gen, ki ga vnese vektor, izrazil, kar bo privedlo do sinteze beljakovine, ki jo kodira omenjeni gen. Nadalje, ko se nosilna celica razmnoži, bodo nastale celice vsebovale tudi omenjeni gen in tako ustvarile nova gensko spremenjena celična linija.

Faze pridobivanja rDNA so naslednje:

1- Izolacija in čiščenje gena, ki nas zanima

V tem prvem koraku je cilj izolirati gen, ki se rekombinira (na primer gen za človeški inzulin ali rastni faktor itd.)

• Pridobivanje celične DNA: Za to je potrebno, da DNA sprosti DNA iz celic, ki jo je treba razbiti s celično lizo. Ko se celice zlomijo, sprostijo svoj genski material (DNA) skupaj z drugimi molekulami, kot so beljakovine ali RNA, zato je treba celično DNA izolirati in očistiti.
• Pridobivanje izoliranega gena: Ko je celična DNA razčlenjena in koncentrirana, je treba DNK razrezati z uporabo restrikcijskih encimov (zelo specifičnih encimov, ki lahko na določenih točkah prekinejo zaporedje DNA). Delovanje ustreznih restrikcijskih encimov sprosti gen, ki ga lahko izoliramo s tehnikami centrifugiranja ali kromatografije.

2- Tvorba rekombinantne DNA

Vektor je genetski material, ki vključiti izolirani gen in ga transportirati znotraj gostiteljske celice.
Vektor je običajno plazmid (krožna DNA, značilna za prokarionte), virus ali umetno ustvarjen kromosom, ki mora izpolnjevati naslednje značilnosti:

• Izolirati bi ga bilo treba in majhne velikosti.
• Vsebovati mora zaporedja, ki jih prepoznajo dejavniki vnosa želenega gena.
• Imeti mora vstop v gostiteljsko celico, da se v njej razmnožuje neodvisno od celične DNA.
• Vsebovati mora genetski marker, ki ga omogoča enostavno prepoznavanje in izolacijo, na primer gen za odpornost na antibiotike.

The obdobja V tej drugi fazi procesa rekombinantne DNA obstajata dve:

1. Izreži vektor: Z uporabo istih restrikcijskih encimov, ki so bili uporabljeni za pridobitev gena, ki ga je treba vstaviti, se v vektorski DNA naredi rez, tako da sta dva konca DNA prosta.
2. Vstavite gen: Prosti konci, ki jih povzroči delovanje restrikcijskih encimov, so točka, kjer bo predhodno izoliran gen vstavljen v prvi fazi izolacije in čiščenja gena. Zveza med vektorjem in genom (ki se enkrat vnese v vektor, se imenuje vložek) nastane z delovanjem encima ligaze, ki katalizira kovalentno vez med vektorjem in vložkom, ki povzroča molekulo Rekombinantna DNA.

3- Uvedba rDNA v gostiteljsko celico

Ta korak lahko naredi različne tehnike na primer spreminjanje s fizikalno-kemijskimi sredstvi prepustnosti gostiteljske celične membrane, ki omogoča prehod rDNA, mikroinjekcija rDNA Z uporabo mikropipete uvedba rDNA v liposome, ki se lahko zlije s celično membrano in sprosti njeno vsebino v celično plazmo celice Gost.

Celice gostiteljice morajo biti celice, ki se zelo hitro razmnožujejo z uporabo bodisi bakterijskih celic, kvasnih celic ali rakavih celic.

4- Kultura gostiteljskih celic

Ko je rDNA vnesena v gostiteljske celice, te gojijo s spodbujanjem njihove delitve da dobimo veliko število celic, ki vsebujejo rDNA. Celice gojijo v Petrijevih posodah, ki omogočajo izolacijo kolonij. ki jih pozneje gojimo v tekočih medijih in tako dobimo veliko število klonov (gensko enakih celic ).

5- Odkrivanje in izbira celic, ki vsebujejo rekombinantno DNA

V tej zadnji fazi gre za identificirati celice z rDNA. Za identifikacijo teh celic se z markerji zazna prisotnost rDNA. Te Genetski označevalci so lahko raznoliki, primer bi bila kultura gostiteljskih celic v prisotnosti a antibiotik. Ko je gen za odpornost na antibiotike, prisoten v kulturi, že vključen v rDNA.