Recombinant DNA: ความหมายและกระบวนการ
เทคนิคของ ดีเอ็นเอลูกผสม (DNAr) เป็นเทคนิคที่ใช้พันธุวิศวกรรมและที่ประกอบด้วยการสร้าง ในหลอดทดลอง ของโมเลกุลดีเอ็นเอเทียมที่มีการรวมสารพันธุกรรมจากสายพันธุ์ต่างๆ ด้วยเหตุผลนี้ โมเลกุลที่ได้รับจึงเรียกว่าไคเมอริกดีเอ็นเอหรือไคเมรา
เทคนิคนี้เป็นพื้นฐานของเทคโนโลยีชีวภาพและพันธุวิศวกรรม และมีการใช้งานที่หลากหลายตั้งแต่การเกษตรไปจนถึงชีวการแพทย์ ตัวอย่างเช่น อนุญาตให้ศึกษาการแสดงออกของยีนบางตัว การได้มาซึ่งสปีชีส์ พืชที่แสดงการดื้อต่อศัตรูพืชบางชนิดหรือได้รับอินซูลินของมนุษย์จากแหล่งต่างๆ สัตว์
ในบทเรียนนี้จากครู เราจะแสดงให้คุณเห็น คำจำกัดความของ recombinant DNA มีไว้เพื่ออะไรและกระบวนการ ที่จัดขึ้น เราจะวิเคราะห์ทุกขั้นตอนเพื่อให้คุณรู้จักเทคนิคทางพันธุกรรมนี้ดีขึ้น เราเริ่ม!
เทคนิคดีเอ็นเอลูกผสมประกอบด้วย แนะนำยีนที่เลือกให้เป็นเวกเตอร์ เวกเตอร์เป็นลำดับเล็ก ๆ ของ ดีเอ็นเอ ที่แยกออกได้ง่าย เช่น a พลาสมิด (DNA แบบวงกลมและนอกโครโมโซมตามแบบฉบับของแบคทีเรียและสิ่งมีชีวิตโปรคาริโอตอื่นๆ)
พาหะนำยีนที่น่าสนใจมาสู่เซลล์เจ้าบ้านซึ่งจะสามารถ ทำซ้ำโดยไม่ขึ้นกับ DNA ของเซลล์
DNA รีคอมบิแนนท์มีไว้เพื่ออะไร?
การใช้กลไกของเซลล์เจ้าบ้าน ยีนที่เวกเตอร์นำเสนอจะถูกแสดงออกซึ่งนำไปสู่การสังเคราะห์โปรตีนที่เข้ารหัสโดยยีนดังกล่าว นอกจากนี้ เมื่อเซลล์พาหะจำลองแบบ เซลล์ที่ได้ก็จะมียีนดังกล่าวด้วย ทำให้เกิดเป็น สายเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมใหม่
ภาพ: ประตูการวิจัย
ขั้นตอนของการได้รับ rDNA มีดังนี้:
1- การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของยีนที่สนใจ
ในขั้นตอนแรกนี้ จุดมุ่งหมายคือการแยกยีนที่จะรวมตัวกันใหม่ (เช่น ยีนของอินซูลินของมนุษย์หรือปัจจัยการเจริญเติบโต เป็นต้น)
- การได้รับ DNA ของเซลล์: สำหรับสิ่งนี้ จำเป็นสำหรับ DNA เพื่อปลดปล่อย DNA ออกจากเซลล์ ซึ่งจะต้องถูกทำลายโดยการสลายเซลล์ เมื่อเซลล์แตกสลาย พวกมันจะปล่อยสารพันธุกรรม (DNA) ออกมาพร้อมกับโมเลกุลอื่นๆ เช่น โปรตีนหรืออาร์เอ็นเอ ซึ่งเป็นสาเหตุที่จำเป็นต้องแยกและชำระ DNA ของเซลล์ให้บริสุทธิ์
- การได้รับยีนที่แยกได้: เมื่อ DNA ของเซลล์ได้รับการทำให้เป็นคู่และเข้มข้นแล้ว จำเป็นต้องตัด DNA โดยใช้เอนไซม์จำกัด (เอนไซม์ที่จำเพาะเจาะจงมากที่สามารถทำลายลำดับ DNA ได้ในบางจุด) การกระทำของเอ็นไซม์จำกัดที่เหมาะสมจะปลดปล่อยยีนซึ่งสามารถแยกออกได้โดยวิธีการหมุนเหวี่ยงหรือเทคนิคโครมาโตกราฟี
2- การก่อตัวของดีเอ็นเอลูกผสม
เวกเตอร์เป็นสารพันธุกรรมที่ รวมยีนที่แยกได้และขนส่งมัน ภายในเซลล์โฮสต์
เวกเตอร์มักจะเป็นพลาสมิด (DNA แบบวงกลมตามแบบฉบับของโปรคาริโอต) ไวรัสหรือโครโมโซมที่ประดิษฐ์ขึ้นซึ่งต้องเป็นไปตามลักษณะดังต่อไปนี้:
- ควรแยกได้ง่ายและมีขนาดเล็ก
- ต้องมีลำดับที่รับรู้โดยปัจจัยในการแนะนำยีนที่ต้องการ
- ต้องสามารถเข้าไปในเซลล์เจ้าบ้านเพื่อทำซ้ำภายในเซลล์โดยไม่ขึ้นกับ DNA ของเซลล์
- ต้องมีเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่ช่วยให้สามารถระบุและแยกออกได้ง่าย เช่น ยีนต้านทานยาปฏิชีวนะ
ขั้นตอน มีสองขั้นตอนที่สองของกระบวนการดีเอ็นเอลูกผสม:
- ตัดเวกเตอร์: การใช้เอ็นไซม์จำกัดแบบเดียวกับที่ใช้เพื่อให้ได้ยีนที่จะแทรกเข้าไป การตัดจะทำในดีเอ็นเอของเวกเตอร์ โดยปล่อยให้ปลายทั้งสองของดีเอ็นเอปราศจากการเสียดสี
- ใส่ยีน: ปลายอิสระที่เกิดจากการกระทำของเอนไซม์จำกัดเป็นจุดที่ยีนที่แยกได้ก่อนหน้านี้จะถูกแทรกในระยะแรกของการแยกและทำให้บริสุทธิ์ของยีน การรวมตัวระหว่างเวกเตอร์และยีน (ซึ่งครั้งหนึ่งเคยถูกนำเข้าสู่เวกเตอร์เรียกว่า เม็ดมีด) เกิดขึ้นจากการกระทำ ของเอนไซม์ไลกาสที่กระตุ้นพันธะโควาเลนต์ระหว่างเวกเตอร์และส่วนแทรกทำให้เกิดโมเลกุลของ ดีเอ็นเอลูกผสม
3- การแนะนำ rDNA เข้าสู่เซลล์โฮสต์
ขั้นตอนนี้สามารถทำได้โดย เทคนิคต่างๆ เช่น การเปลี่ยนแปลงโดยวิธีทางเคมีกายภาพ หมายถึง การซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์เจ้าบ้านเพื่อให้ผ่าน rDNA การฉีดไมโครของ rDNA การใช้ไมโครปิเปต การแนะนำ rDNA เข้าไปในไลโปโซมที่สามารถหลอมรวมกับเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อปลดปล่อยเนื้อหาเข้าไปในไซโตพลาสซึมของเซลล์ แขก.
เซลล์เจ้าบ้านต้องเป็นเซลล์ที่สืบพันธุ์ได้เร็วมาก โดยใช้เซลล์แบคทีเรีย เซลล์ยีสต์ หรือเซลล์มะเร็ง
4- การเพาะเลี้ยงเซลล์เจ้าบ้าน
เมื่อ rDNA ถูกนำเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านแล้ว พวกมันจะเป็น ได้รับการปลูกฝังโดยการทำให้เกิดการแบ่งแยกของพวกเขา เพื่อให้ได้เซลล์จำนวนมากที่มี rDNA เซลล์ปลูกในจานเพาะเชื้อที่ช่วยให้แยกอาณานิคมได้ ซึ่งต่อมาเติบโตในสื่อของเหลวจึงได้รับโคลนจำนวนมาก (เซลล์ที่เหมือนกันทางพันธุกรรม ).
5- การตรวจหาและการคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA ลูกผสม
ในขั้นตอนสุดท้ายนี้จะเกี่ยวกับ ระบุเซลล์ด้วย rDNA เพื่อระบุเซลล์เหล่านี้ เครื่องหมายถูกใช้เพื่อตรวจหาการมีอยู่ของ rDNA เหล่านี้ ตัวบ่งชี้ทางพันธุกรรมสามารถมีความหลากหลายได้ ตัวอย่างเช่น การเพาะเลี้ยงเซลล์เจ้าบ้านต่อหน้า a ยาปฏิชีวนะ เมื่อก่อนหน้านี้มีการรวมยีนต้านทานยาปฏิชีวนะในวัฒนธรรมเข้ากับ rDNA