Метод на Брадфорд: какво е и как работи

Протеините са макромолекули, изградени от аминокиселини. Около 500 различни аминокиселини са описани в природата, но любопитно е, че само 20 са основните, които присъстват в човешкото тяло. ДНК съдържа цялата информация, необходима за протеин да бъде синтезиран, тъй като през механизми на транскрипция и транслация, триплет ДНК нуклеотиди се превръща в аминокиселина бетон.

Рибозомите са органелите, отговорни за сглобяването на тези аминокиселини, пораждащи вериги с порядъци и променлива дължина, или това, което е същото, това, което познаваме като протеини. Тези биомолекули са от съществено значение за зачеването на живота, тъй като те представляват приблизително 80% от сухата протоплазма във всяка клетка и представляват 50% от теглото във всички живи тъкани.

С тези данни на ръка ни е повече от ясно значението на протеините в генерирането на живот. Днес идваме да ви представим един много интересен механизъм, свързан с тази тема, защото ще ви разкажем всичко за Методът на Брадфорд, предназначени да определят количествено концентрацията на протеин в разтвор.

• Свързана статия: „Какво представлява научният метод и как работи?“

Какво представлява методът на Брадфорд?

Методът на Брадфорд (известен като протеиново есе на Брадфордс на английски) е описан, както подсказва името му, от американския учен Марион Макинли Брадфорд през 1976 г. Преди всичко е необходимо да се подчертае това Това е спектрометричен метод, термин, който обхваща набор от лабораторни процедури, базирани на взаимодействието на електромагнитното излъчване с аналит (интересният компонент, който искате да отделите от матрицата).

В допълнение към това, трябва да се отбележи, че това е метод с колориметричен характер, т.е. получава резултати въз основа на цветовете и тяхната концентрация в конкретен разтвор. Ключът към този терминологичен конгломерат се намира в багрилото „Coomassie blue”, тъй като методът на Брадфорд определя количествено промените в неговата абсорбция според определени параметри. Това багрило изглежда синьо в анионната си форма, зелено в неутралната си форма и червено в катионната си форма.

При киселинни условия в разтвор, Coomassie blue се превръща от червено в синьо и в процеса се свързва с белтъците, които трябва да бъдат определени количествено. Ако във водната среда няма протеини, сместа остава кафява, така че е много лесно да се открие присъствието на тези макромолекули на първо място с тази методология.

Химичните основи на метода на Брадфорд

Навлизаме в малко по-сложен терен, тъй като е време да опишем какво се случва между тези молекули извън директните промени в цвета. Когато се свързва с протеина, Coomassie blue в неговата катионна и двойно протонирана форма (червено) образува много силна нековалентна връзка със споменатата макромолекула., чрез сили на ван дер Ваалс и електростатични взаимодействия.

По време на образуването на този химичен комплекс багрилото дарява на йонизиращите се части на протеина свободен електрон (не забравяйте, че катионът = положителен заряд, губи електрони), което причинява нарушаване на белтъчното състояние нормално. Това излага някои вещества, които могат да генерират описаните по-рано обединения, в които няма да спрем поради тяхната химическа сложност. В обобщение трябва да знаете само следното:

Червено багрило (катионно / несвързано с протеин) ≠ Синьо багрило (анионно / свързано с протеин)

Въз основа на тази предпоставка трябва да се отбележи, че червеното багрило има абсорбционен спектър от 465 nm, стойност, която представлява падащото електромагнитно излъчване, което материалът поглъща в диапазон от честоти. В анионната синя форма (взаимодействаща с протеини), промяната в абсорбцията настъпва при 595 nm. Следователно, в разтвор, подложен на метода на Брадфорд, отчитанията се правят в спектрофотометри в диапазон от 595 nm.

Увеличението на абсорбцията в този спектър е право пропорционално на броя на връзките между багрилото и протеините, така че не Установява се само, че има протеини с промяната на цвета, но също така е възможно да се изчисли колко протеин има на милилитър среда течност. Невероятно вярно?

• Може да се интересувате от: "Лабораторен материал: 23 основни предмета и инструменти"

Процедура по метод на Брадфорд

За да се приложи тази методология, е необходим спектрофотометър, който не е точно евтин (приблизително 2000 евро), така че не е нещо, което може да се управлява от дома. Тази машина е способна да прожектира едноцветен лъч светлина през проба, за да измери количеството светлина, което се абсорбира от съединенията, които представляват интерес. По този начин изследователят получава информация за естеството на молекулите във въпросния разтвор и, между другото, също е в състояние да изчисли концентрацията на споменатата молекула.

Освен това трябва да се отбележи, че реагентът не е просто „суров“ Coomassie blue. 100 милиграма от багрилото трябва да се разтворят в 50 милилитра 95% разтвор на етанол и да се добавят 100 милилитра 85% фосфорна киселина. Освен това е необходимо да се разрежда до един литър, след като багрилото се разтвори и сместа се филтрира, за да се получи окончателният реагент, използван в метода. Цветът на този разтвор без налични протеини, както казахме, трябва да е кафеникав.

След като изследователят разполага с реагента и спектрофотометъра, той трябва да изпълни следните стъпки:

• Пригответе спектрофотометъра и проверете правилната му работа.
• Пригответе протеиновия разтвор за анализ. В идеалния случай тази проба трябва да съдържа между 5 и 100 микрограма протеин на 100 микролитра общ разтвор. Очевидно е, че точната концентрация не е известна, но те са максималните и минималните стойности.
• Подгответе стандарти. Няма да навлизаме в техните особености поради химическото усложнение, което пораждат.
• Добавете 5 милилитра реактив към разтвора и го оставете да се инкубира за 5 минути.
• Измерете абсорбцията на сместа на спектрофотометъра при 595 nm.

Резултатите ще се покажат на екрана на спектрофотометъра и трябва да бъдат отбелязани от специалиста, който провежда разследването. След като имат, необходимо е да се създаде графика (калибрационна крива), която е изправена пред две стойности по осите си: абсорбция спрямо микрограми протеин. От кривата, генерирана със стойностите, те могат да бъдат екстраполирани, за да се получи точната концентрация на протеин в разтвора.

Предимство

Методът на Брадфорд е много лесен за изпълнение за всеки, свързан с лабораторната област, тъй като всеки биолог и химик се е сблъсквал със спектрофотометър през годините си на изследване с поне един време. Или за измерване на количеството хлорофил в разтвор от смачкване на листа (типично) до много по-сложни неща, спектрофотометрите са много широко разпространени в областта на изучаване на.

В допълнение към своята лекота, Трябва да се отбележи, че много протеини в естественото си състояние имат изключително нисък обхват на абсорбция, при 280 nm. Дори не всички протеини достигат тази стойност, тъй като за това те трябва да имат специфични аминокиселини (тирозин, фенилаланин и триптофан), които не винаги присъстват. Тъй като тази цифра на абсорбция е в UV диапазона, е необходима специална машина, която почти никой не трябва да ги третира.

Наистина ли, това, което се прави по метода на Брадфорд, е да се "увеличи" стойността на абсорбция на протеините чрез свързване с багрило. Освен че са много по-лесни за четене в това състояние, протеините се отдалечават от спектрите на абсорбция на други биологични молекули, които могат да замърсят пробата.

Продължи

В този малък клас по химия се потопихме в един от най-простите и лесни за изпълнение методи за количествено определяне на протеини, при условие че е наличен съответният материал. Във всеки случай трябва да подчертаем, че както всичко в този живот, той също не е съвършен и безпогрешен: обикновено е необходимо да се направят множество разреждания на пробата за анализ (минимални и максимални стойности от 0 µg / mL до 2000 µg / mL), което може да доведе до грешки по време на процеса.

Освен това, присъствието на детергенти и други съединения в разтвора може да попречи на правилното развитие на метода. За щастие има и други реагенти, които могат да бъдат добавени към сместа за решаване на тези проблеми в много случаи.

Библиографски справки:

• Комптън, С. J., & Jones, C. G. (1985). Механизъм на реакцията на багрилото и интерференция в анализа на протеина в Брадфорд. Аналитична биохимия, 151 (2), 369-374.
• Ернст, О., и Зор, Т. (2010). Линеаризация на Брадфордския протеинов анализ. Списание за визуализирани експерименти: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Чувствителност и вариабилност на Брадфордския протеинов анализ в присъствието на детергенти. Аналитична биохимия, 178 (2), 263-268.
• Той, Ф. (2011). Брадфордски протеинов анализ. Био-протокол, e45-e45.
• Джоунс, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Измерване на растителен протеин с теста на Брадфорд. Списание за химическа екология, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Подобрен тест на Брадфорд за протеини за колагенови протеини. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Линеаризирането на теста за протеини в Брадфорд повишава неговата чувствителност: теоретични и експериментални изследвания. Аналитична биохимия, 236 (2), 302-308.