Bradford metode: hvad det er, og hvordan det fungerer

Proteiner er makromolekyler, der består af aminosyrer. Omkring 500 forskellige aminosyrer er blevet beskrevet i naturen, men mærkeligt nok er kun 20 de væsentlige, der findes i menneskekroppen. DNA indeholder al den information, der er nødvendig for at et protein skal syntetiseres, siden igennem mekanismer for transkription og translation omdannes en triplet af DNA-nukleotider til en aminosyre beton.

Ribosomer er organeller, der er ansvarlige for at samle disse aminosyrer, hvilket giver anledning til kæder med ordrer og variabel længde, eller hvad er det samme, hvad vi kender som proteiner. Disse biomolekyler er essentielle for at blive gravide, da de tegner sig for ca. 80% af det tørre protoplasma i hver celle og repræsenterer 50% af vægten i alle levende væv.

Med disse data i hånden er det mere end klart for os vigtigheden af ​​proteiner i generationen af ​​liv. I dag kommer vi for at bringe dig en meget interessant mekanisme relateret til dette emne, fordi vi vil fortælle dig alt om Bradfords metode, designet til at kvantificere proteinkoncentrationen i en opløsning.

• Relateret artikel: "Hvad er den videnskabelige metode, og hvordan fungerer den?"

Hvad er Bradford-metoden?

Bradford-metoden (kendt som Bradfords protein-essay på engelsk) blev beskrevet, som navnet antyder, af den amerikanske videnskabsmand Marion Mckinley Bradford i 1976. Først og fremmest er det nødvendigt at understrege det Det er en spektrometrisk metode, et udtryk, der omfatter et sæt laboratorieprocedurer baseret på interaktionen mellem elektromagnetisk stråling og en analyt. (den komponent af interesse, som du vil adskille fra matrixen).

Ud over dette skal det bemærkes, at det er en metode af kolorimetrisk karakter, det vil sige opnår resultater baseret på farver og deres koncentration i en bestemt opløsning. Nøglen til dette terminologiske konglomerat findes i "Coomassie blue" -farvestoffet, da Bradford-metoden kvantificerer ændringer i dets absorbans i henhold til visse parametre. Dette farvestof virker blåt i sin anioniske form, grønt i sin neutrale form og rødt i sin kationiske form.

Under sure betingelser i opløsning bliver Coomassie blue fra rød til blå og binder i processen til de proteiner, der skal kvantificeres. Hvis der ikke er proteiner i det vandige medium, forbliver blandingen brun, så det er meget let at påvise tilstedeværelsen af ​​disse makromolekyler i første omgang med denne metode.

De kemiske baser i Bradford-metoden

Vi går ind i et lidt mere komplekst terræn, da det er tid til at beskrive, hvad der sker mellem disse molekyler ud over direkte farveændringer. Ved sammenføjning med proteinet danner Coomassie blue i sin kationiske og dobbelt protonerede form (rød) en meget stærk ikke-kovalent binding med nævnte makromolekyle.ved hjælp af van der waals kræfter og elektrostatiske interaktioner.

Under dannelsen af ​​dette kemiske kompleks donerer farvestoffet til de ioniserbare dele af proteinet fri elektron (husk at kation = positiv ladning, mister elektroner), hvilket forårsager forstyrrelse af proteintilstanden normal. Dette udsætter visse stoffer, der kan generere de tidligere beskrevne fagforeninger, hvor vi ikke vil stoppe på grund af deres kemiske kompleksitet. Sammenfattende behøver du kun at vide følgende:

Rødt farvestof (kationisk / ikke bundet til protein) ≠ Blåt farvestof (anionisk / bundet til protein)

Baseret på denne forudsætning skal det bemærkes, at det røde farvestof har et absorptionsspektrum på 465 nm, en værdi, der repræsenterer den indfaldende elektromagnetiske stråling, som et materiale absorberer inden for et frekvensområde. I den anioniske blå form (interagerer med proteiner) sker en ændring i absorption ved 595 nm. Af denne grund foretages aflæsninger i en opløsning underkastet Bradford-metoden i spektrofotometre i et område på 595 nm.

Forøgelsen i absorbans i dette spektrum er direkte proportional med antallet af bindinger mellem farvestoffet og proteinerne, så det gør det ikke Det registreres kun, at der er proteiner med farveændring, men det er også muligt at estimere, hvor meget protein der er pr. Milliliter medium væske. Utrolig sandt?

• Du kan være interesseret i: "Laboratoriemateriale: 23 væsentlige objekter og instrumenter"

Bradford metode procedure

For at udføre denne metode er et spektrofotometer nødvendigt, hvilket ikke er lige billigt (ca. 2.000 euro), så det er ikke noget, der kan køres hjemmefra. Denne maskine er i stand til at projicere en monokromatisk lysstråle gennem en prøve for at måle den mængde lys, der absorberes af de interessante forbindelser. Således modtager forskeren information om molekylernes art i den pågældende opløsning og er i øvrigt også i stand til at beregne koncentrationen af ​​molekylet.

Desuden skal det bemærkes, at reagenset ikke kun er "rå" Coomassie-blå. 100 mg farvestof opløses i 50 ml 95% ethanolopløsning og 100 ml 85% fosforsyre tilsættes. Derudover er det nødvendigt at fortynde det til en liter, når farvestoffet er opløst og filtrere blandingen for at give anledning til det endelige reagens, der anvendes i metoden. Farven på denne opløsning uden proteiner til stede, som vi har sagt, skal være brunlig.

Når forskeren har reagenset og spektrofotometeret, skal han følge følgende trin:

• Forbered spektrofotometeret, og kontroller, at det fungerer korrekt.
• Forbered proteinopløsningen, der skal analyseres. Ideelt set bør denne prøve indeholde mellem 5 og 100 mikrogram protein pr. 100 mikroliter total opløsning. Det er indlysende, at den nøjagtige koncentration ikke er kendt, men de er maksimums- og minimumsværdier.
• Forbered standarder. Vi vil ikke gå ind på deres særlige forhold på grund af den kemiske komplikation, de medfører.
• Tilsæt 5 ml reagens til opløsningen, og lad den inkubere i 5 minutter.
• Mål absorbans af blandingen på spektrofotometeret ved 595 nm.

Resultaterne vises på spektrofotometerskærmen og skal bemærkes af den professionelle, der gennemfører undersøgelsen. Når de har det er nødvendigt at oprette en graf (kalibreringskurve), der står over for to værdier på deres akser: absorbans vs mikrogram protein. Fra kurven genereret med værdierne kan disse ekstrapoleres for at opnå den nøjagtige koncentration af protein i opløsningen.

Fordel

Bradford-metoden er meget let at udføre for alle, der er relateret til laboratoriefeltet, da enhver biolog og kemiker har stået over for et spektrofotometer i løbet af sine år med studier mindst en tid. Enten for at måle mængden af ​​klorofyl i en opløsning fra knusning af et blad (typisk) til meget mere komplekse ting er spektrofotometre meget udbredte inden for læring.

Ud over sin lethed Det skal bemærkes, at mange proteiner i deres naturlige tilstand har et ekstremt lavt absorptionsområde ved 280 nm. Ikke engang alle proteiner når denne værdi, for til dette skal de have specifikke aminosyrer (tyrosin, phenylalanin og tryptophan), som ikke altid er til stede. Da dette absorbanstal er inden for UV-området, er det nødvendigt med en speciel maskine, som næsten ingen skal behandle dem.

Virkelig, hvad der gøres i Bradford-metoden er at "øge" absorbansværdien af ​​proteiner ved binding til et farvestof. Ud over at være meget lettere at læse i denne tilstand, bevæger proteinerne sig væk fra absorbansspektrene for andre biologiske molekyler, hvilket kan forurene prøven.

Genoptag

I denne lille kemiklasse har vi fordybet os i en af ​​de enkleste og nemmeste proteinkvantificeringsmetoder at udføre, forudsat at det relevante materiale er tilgængeligt. Under alle omstændigheder må vi understrege, at det, som alt andet i dette liv, heller ikke er perfekt og ufejlbarligt: ​​det er normalt nødvendigt at lave flere fortyndinger af prøven til analyse (minimums- og maksimumværdier på 0 µg / ml til 2000 µg / ml), hvilket kan føre til fejl under processen.

Endvidere kan tilstedeværelsen af ​​vaskemidler og andre forbindelser i opløsningen forhindre den korrekte udvikling af metoden. Heldigvis er der andre reagenser, der kan tilsættes blandingen for at løse disse problemer i mange tilfælde.

Bibliografiske referencer:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mekanisme for farvestofrespons og interferens i Bradford-proteinassayet. Analytisk biokemi, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Linearisering af Bradford-proteinassayet. Tidsskrift for visualiserede eksperimenter: JoVE, (38).
• Friedenauer, S. og Berlet, H. H. (1989). Følsomhed og variation i Bradford-proteinanalysen i nærværelse af vaskemidler. Analytisk biokemi, 178 (2), 263-268.
• Han, F. (2011). Bradford-proteinassay. Bioprotokol, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Måling af planteprotein med Bradford-analysen. Journal of chemical ecology, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Et forbedret Bradford-proteinassay for kollagenproteiner. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. og Selinger, Z. (1996). Linearisering af Bradford-proteinassayet øger dets følsomhed: teoretiske og eksperimentelle undersøgelser. Analytisk biokemi, 236 (2), 302-308.