Bradford-Methode: Was es ist und wie es funktioniert

Proteine ​​sind Makromoleküle, die aus Aminosäuren bestehen. In der Natur wurden etwa 500 verschiedene Aminosäuren beschrieben, aber seltsamerweise sind nur 20 die essentiellen Aminosäuren, die im menschlichen Körper vorhanden sind. Die DNA enthält alle Informationen, die für die Synthese eines Proteins notwendig sind, da durch Transkriptions- und Translationsmechanismen wird ein Triplett von DNA-Nukleotiden in eine Aminosäure umgewandelt Beton.

Ribosomen sind die Organellen, die für den Aufbau dieser Aminosäuren verantwortlich sind, wodurch Ketten mit Ordnungen und variabler Länge entstehen, oder was dasselbe ist, was wir als Proteine ​​​​kennen. Diese Biomoleküle sind essentiell für die Empfängnis des Lebens, da sie etwa 80 % des trockenen Protoplasmas in jeder Zelle ausmachen und 50 % des Gewichts in allen lebenden Geweben ausmachen.

Mit diesen Daten ist uns die Bedeutung von Proteinen bei der Entstehung von Leben mehr als klar. Heute kommen wir, um Ihnen einen sehr interessanten Mechanismus zu diesem Thema zu präsentieren, denn wir werden Ihnen alles darüber erzählen

Bradfords Methode, entwickelt, um die Proteinkonzentration einer Lösung zu quantifizieren.

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Was ist die Bradford-Methode?

Die Bradford-Methode (im Englischen als Bradfords Protein Essay bekannt) wurde, wie der Name schon sagt, 1976 von der amerikanischen Wissenschaftlerin Marion Mckinley Bradford beschrieben. Zuallererst muss betont werden, dass Es ist eine spektrometrische Methode, ein Begriff, der eine Reihe von Laborverfahren umfasst, die auf der Wechselwirkung elektromagnetischer Strahlung mit einem Analyten basieren (die interessierende Komponente, die Sie von der Matrix trennen möchten).

Darüber hinaus ist zu beachten, dass es sich um eine kolorimetrische Methode handelt, das heißt, dass erhält Ergebnisse basierend auf Farben und deren Konzentration in einer bestimmten Lösung. Der Schlüssel zu diesem terminologischen Konglomerat liegt im Farbstoff "Coomassie blue", da die Bradford-Methode die Änderungen seiner Extinktion nach bestimmten Parametern quantifiziert. Dieser Farbstoff erscheint in seiner anionischen Form blau, in seiner neutralen Form grün und in seiner kationischen Form rot.

Unter sauren Bedingungen in Lösung färbt sich Coomassie-Blau von Rot nach Blau und bindet dabei an die zu quantifizierenden Proteine. Befinden sich keine Proteine ​​im wässrigen Medium, bleibt die Mischung braun, so dass es mit dieser Methodik zunächst sehr einfach ist, das Vorhandensein dieser Makromoleküle nachzuweisen.

Die chemischen Grundlagen der Bradford-Methode

Wir betreten ein etwas komplexeres Terrain, da es an der Zeit ist, zu beschreiben, was zwischen diesen Molekülen jenseits direkter Farbänderungen passiert. Beim Verbinden mit dem Protein geht Coomassie-Blau in seiner kationischen und doppelt protonierten Form (rot) eine sehr starke nicht-kovalente Bindung mit diesem Makromolekül ein., durch Van-der-Waals-Kräfte und elektrostatische Wechselwirkungen.

Bei der Bildung dieses chemischen Komplexes spendet der Farbstoff an die ionisierbaren Teile des Proteins seine freies Elektron (denken Sie daran, dass Kation = positive Ladung, verliert Elektronen), wodurch der Proteinzustand gestört wird normal. Dadurch werden bestimmte Stoffe freigelegt, die die zuvor beschriebenen Verbindungen erzeugen können, bei denen wir aufgrund ihrer chemischen Komplexität nicht aufhören werden. Zusammenfassend müssen Sie nur Folgendes wissen:

Roter Farbstoff (kationisch / nicht an Protein gebunden) ≠ Blauer Farbstoff (anionisch / an Protein gebunden)

Ausgehend von dieser Prämisse ist zu beachten, dass der rote Farbstoff hat ein Absorptionsspektrum von 465 nm, ein Wert, der die einfallende elektromagnetische Strahlung darstellt, die ein Material innerhalb eines Frequenzbereichs absorbiert. In der anionischen blauen Form (wechselwirkend mit Proteinen) tritt eine Absorptionsänderung bei 595 nm auf. Aus diesem Grund werden in einer dem Bradford-Verfahren unterzogenen Lösung Messungen in Spektralphotometern im Bereich von 595 nm durchgeführt.

Die Zunahme der Extinktion in diesem Spektrum ist direkt proportional zur Anzahl der Bindungen zwischen dem Farbstoff und den Proteinen, also nicht Es wird nur festgestellt, dass es Proteine ​​mit dem Farbwechsel gibt, aber es ist auch möglich abzuschätzen, wie viel Protein pro Milliliter Medium vorhanden ist Flüssigkeit. Unglaublich wahr?

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Verfahren der Bradford-Methode

Um diese Methodik durchzuführen, ist ein Spektralfotometer notwendig, das nicht gerade billig ist (ca. 2.000 Euro), also nichts, was man von zu Hause aus betreiben kann. Dieses Gerät kann einen monochromatischen Lichtstrahl durch eine Probe projizieren, um die Lichtmenge zu messen, die von den interessierenden Verbindungen absorbiert wird. So erhält der Forscher Informationen über die Beschaffenheit der Moleküle in der jeweiligen Lösung und kann nebenbei auch noch deren Konzentration berechnen.

Weiterhin ist zu beachten, dass es sich bei dem Reagenz nicht nur um „rohes“ Coomassie-Blau handelt. 100 Milligramm des Farbstoffs sollten in 50 Milliliter einer 95%igen Ethanollösung gelöst und mit 100 Millilitern 85%iger Phosphorsäure versetzt werden. Außerdem ist es notwendig, es nach Auflösung des Farbstoffs auf einen Liter zu verdünnen und die Mischung zu filtrieren, um das endgültige Reagenz für das Verfahren zu erhalten. Die Farbe dieser Lösung ohne vorhandene Proteine ​​sollte, wie gesagt, bräunlich sein.

Sobald der Forscher das Reagenz und das Spektralfotometer hat, muss er die folgenden Schritte ausführen:

• Bereiten Sie das Spektralfotometer vor und überprüfen Sie seine korrekte Funktion.
• Bereiten Sie die zu analysierende Proteinlösung vor. Idealerweise sollte diese Probe zwischen 5 und 100 Mikrogramm Protein pro 100 Mikroliter Gesamtlösung enthalten. Es ist offensichtlich, dass die genaue Konzentration nicht bekannt ist, aber es sind die maximalen und minimalen Werte.
• Bereiten Sie Standards vor. Wir werden nicht auf ihre Besonderheiten aufgrund der chemischen Komplikation eingehen, die sie mit sich bringen.
• Fügen Sie der Lösung 5 Milliliter Reagenz hinzu und lassen Sie sie 5 Minuten lang inkubieren.
• Messen Sie die Extinktion der Mischung auf dem Spektrophotometer bei 595 nm.

Die Ergebnisse erscheinen auf dem Bildschirm des Spektralfotometers und sollten vom Fachmann, der die Untersuchung durchführt, notiert werden. Sobald sie es haben, es ist notwendig, ein Diagramm (Kalibrierungskurve) zu erstellen, das zwei Werten auf ihren Achsen gegenüberliegt: Absorption vs. Mikrogramm Protein. Aus der mit den Werten erzeugten Kurve können diese extrapoliert werden, um die genaue Proteinkonzentration in der Lösung zu erhalten.

Vorteil

Die Bradford-Methode ist für jeden, der mit dem Laborbereich zu tun hat, sehr einfach durchzuführen. da jeder Biologe und Chemiker in seinen Studienjahren mindestens ein Spektralphotometer gesehen hat Zeit. Entweder um die Chlorophyllmenge in einer Lösung aus dem Zerkleinern eines Blattes zu messen (typisch) zu viel komplexeren Dingen sind Spektralphotometer in den Bereichen der fields Lernen.

Neben seiner Leichtigkeit, Es sollte beachtet werden, dass viele Proteine ​​in ihrem natürlichen Zustand einen extrem niedrigen Absorptionsbereich haben, bei 280 nm. Nicht einmal alle Proteine ​​erreichen diesen Wert, denn dafür müssen sie über bestimmte Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan) verfügen, die nicht immer vorhanden sind. Da dieser Extinktionswert im UV-Bereich liegt, ist eine spezielle Maschine erforderlich, über die fast niemand verfügt, um sie behandeln zu können.

Ja wirklich, Bei der Bradford-Methode wird der Absorptionswert von Proteinen durch Bindung an einen Farbstoff "erhöht".. Die Proteine ​​sind in diesem Zustand nicht nur viel leichter lesbar, sondern entfernen sich auch von den Absorptionsspektren anderer biologischer Moleküle, die die Probe kontaminieren könnten.

Fortsetzen

In diesem kleinen Chemieunterricht haben wir uns in eine der einfachsten und einfachsten Methoden zur Proteinquantifizierung vertieft, sofern das entsprechende Material zur Verfügung steht. Auf jeden Fall müssen wir betonen, dass es wie alles in diesem Leben auch nicht perfekt und unfehlbar ist: Es ist normalerweise notwendig, mehrere zu machen Verdünnungen der Probe für die Analyse (Mindest- und Höchstwerte von 0 µg/mL bis 2000 µg/mL), die zu Fehlern während der Prozess.

Darüber hinaus kann die Anwesenheit von Detergenzien und anderen Verbindungen in der Lösung die korrekte Entwicklung des Verfahrens verhindern. Glücklicherweise gibt es andere Reagenzien, die der Mischung hinzugefügt werden können, um diese Probleme in vielen Fällen zu lösen.

Bibliographische Referenzen:

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