Rekombinantne DNA: määratlus ja protsess

Tehnika Rekombinantne DNA (DNAr) on tehnika, mida kasutatakse geenitehnoloogias ja mis koosneb loomisest in vitro kunstlikest DNA molekulidest, milles on ühendatud erinevate liikide geneetiline materjal. Sel põhjusel nimetatakse sel viisil saadud molekule kimäärseks DNA-ks või kimäärideks.

See tehnika on biotehnoloogia ja geenitehnoloogia alus ning sellel on mitmeid rakendusi alates põllumajandusest kuni biomeditsiinini. Näiteks võimaldab see uurida teatud geeni ekspressiooni, saada liike taimed, mis näitavad resistentsust teatud kahjurite suhtes või saavad iniminsuliini allikatest loomad.

Selles ÕPETAJA õppetükis näitame teile rekombinantse DNA määratlus, milleks see on vajalik ja protsess seda peetakse. Analüüsime kõiki etappe, et teaksite paremini seda geenitehnikat. Me alustasime!

Rekombinantse DNA tehnika koosneb valitud geeni viimine vektorisse. Vektor on väike järjestus DNA mida on lihtne isoleerida, näiteks a plasmiid (Bakteritele ja teistele prokarüootsetele organismidele tüüpiline ring- ja ekstrakromosomaalne DNA).

Huvipakkuvat geeni kandev vektor viiakse peremeesrakku, kus see on võimeline kordamaraku DNA-st sõltumatult.

Milleks on rekombinantne DNA?

Peremeesraku mehhanismi abil ekspresseeritakse vektori poolt sisestatud geeni, mis viib nimetatud geeni poolt kodeeritud valgu sünteesini. Peale selle, kui kandurakk kordub, sisaldavad saadud rakud ka nimetatud geeni, luues seega a uus geneetiliselt muundatud rakuliin.

RDNA saamise etapid on järgmised:

1 - huvipakkuva geeni eraldamine ja puhastamine

Selles esimeses etapis on eesmärk rekombineeritav geen isoleerida (näiteks iniminsuliini või kasvufaktori geen jne).

• Rakulise DNA saamine: Selleks on vajalik, et DNA vabastaks rakkudest DNA, mis tuleb rakulüüsil purustada. Rakkude purunemisel vabastavad nad oma geneetilise materjali (DNA) koos teiste molekulidega, näiteks valkude või RNA-ga, mistõttu on vajalik rakuline DNA isoleerida ja puhastada.
• Isoleeritud geeni saamine: Kui rakuline DNA on parifitseeritud ja kontsentreeritud, tuleb DNA lõigata restriktsiooniensüümide abil (väga spetsiifilised ensüümid, mis on võimelised teatud punktides DNA järjestust lõhkuma). Sobivate restriktsiooniensüümide toimel vabaneb geen, mida saab eraldada tsentrifuugimise või kromatograafia meetodite abil.

2- Rekombinantse DNA moodustumine

Vektor on geneetiline materjal, mis lisada isoleeritud geen ja transportida seda peremeesraku sees.
Vektor on tavaliselt plasmiid (prokarüootidele tüüpiline ümmargune DNA), viirus või kunstlikult loodud kromosoom, mis peab vastama järgmistele omadustele:

• See peaks olema lihtne isoleerida ja väike.
• See peab sisaldama järjestusi, mida tunnevad ära soovitud geeni sisestamise tegurid.
• See peab olema võimeline sisenema peremeesrakku, et selle sees paljuneda raku DNA-st.
• See peab sisaldama geneetilist markerit, mis võimaldab seda hõlpsasti tuvastada ja eraldada, näiteks antibiootikumiresistentsuse geen.

The etapid Rekombinantse DNA protsessi selles teises faasis on kaks:

1. Lõika vektor: Kasutades samu restriktsiooniensüüme, mida kasutati sisestatava geeni saamiseks, tehakse vektor-DNA-s lõige, jättes DNA kaks otsa vabaks.
2. Sisestage geen: Piiranguensüümide toimest põhjustatud vabad otsad on see koht, kuhu eelnevalt eraldatud geen sisestatakse geeni eraldamise ja puhastamise esimeses etapis. Vektori ja geeni (mida vektorisse sisestatakse, nimetatakse insertiks) liit tekib toimega ensüümi ligaasi, mis katalüüsib vektori ja inserdi vahelist kovalentset sidet, mille tulemusena moodustub Rekombinantne DNA.

3- rDNA sisestamine peremeesrakku

Selle sammu saab teha erinevad tehnikad näiteks füüsikalis-keemiliste vahendite abil peremeesraku membraani läbilaskvuse muutmine rDNA läbipääsu võimaldamiseks, rDNA mikroinjektsioon Mikropipeti abil sisestatakse rDNA liposoomidesse, mis on võimelised sulanduma rakumembraaniga, vabastades selle sisu raku tsütoplasmas. Külaline.

Peremeesrakud peavad olema rakud, mis paljunevad väga kiiresti, kasutades kas bakterirakke, pärmirakke või vähirakke.

4. Peremeesrakkude kultuur

Kui rDNA on peremeesrakkudesse viidud, siis need kasvatatakse nende jagunemist esile kutsudes suure hulga rDNA-d sisaldavate rakkude saamiseks. Rakke kasvatatakse Petri tassides, mis võimaldavad kolooniaid isoleerida. mida seejärel kasvatatakse vedelas keskkonnas, saades seeläbi suure hulga kloone (geneetiliselt identsed rakud ).

5. Rekombinantset DNA-d sisaldavate rakkude tuvastamine ja selekteerimine

Selles viimases etapis on see umbes tuvastada rakud rDNA-ga. Nende rakkude tuvastamiseks kasutatakse markereid rDNA olemasolu tuvastamiseks. Need Geneetilised markerid võivad olla erinevad, näiteks on peremeesrakkude kultuur a. Juuresolekul antibiootikum. Kui kultuuris sisalduv antibiootikumiresistentsuse geen on eelnevalt rDNA sisse viidud.