Bradfordi meetod: mis see on ja kuidas see töötab

Valgud on aminohapetest koosnevad makromolekulid. Looduses on kirjeldatud umbes 500 erinevat aminohapet, kuid kummalisel kombel on inimkehas hädavajalikud ainult 20. DNA sisaldab kogu valgu sünteesimiseks vajalikku teavet alates sellest ajast transkriptsiooni ja translatsiooni mehhanismide abil muudetakse DNA nukleotiidide triplett aminohappeks betoonist.

Ribosoomid on nende aminohapete ühendamise eest vastutavad organellid, mis tekitavad muutuva järjestuse ja pikkusega ahelad või mis on sama, mida me teame valkudena. Need biomolekulid on elu eostamiseks hädavajalikud, kuna need moodustavad igas rakus umbes 80% kuivast protoplasmast ja kõigis eluskudedes 50% kaalust.

Kui need andmed on käes, on meile valkude tähtsus elu loomisel enam kui selge. Täna toome teieni selle teemaga seotud väga huvitava mehhanismi, sest me räägime teile kõigest Bradfordi meetod, mis on ette nähtud lahuse valgu kontsentratsiooni kvantifitseerimiseks.

• Seotud artikkel: "Mis on teaduslik meetod ja kuidas see töötab?"

Mis on Bradfordi meetod?

Bradfordi meetodit (inglise keeles tuntud kui Bradfordi proteiiniessee) kirjeldas ameerika teadlane Marion Mckinley Bradford, nagu nimigi ütleb, 1976. aastal. Kõigepealt on vaja seda rõhutada See on spektromeetriline meetod, termin, mis hõlmab laboriprotseduuride komplekti, mis põhineb elektromagnetkiirguse ja analüüdi koostoimel (huvi pakkuv komponent, mida soovite maatriksist eraldada).

Lisaks sellele tuleb märkida, et see on kolorimeetrilise iseloomuga meetod, see tähendab saab tulemusi värvide ja nende kontsentratsiooni põhjal konkreetses lahuses. Selle terminoloogilise konglomeraadi võti on värvis “Coomassie blue”, kuna Bradfordi meetod kvantifitseerib selle neelduvuse muutused vastavalt teatud parameetritele. See värv on anioonsel kujul sinine, neutraalsel kujul roheline ja katioonkujul punane.

Lahuse happelistes tingimustes muutub Coomassie sinine punasest siniseks ja seondub protsessis kvantifitseeritavate valkudega. Kui vesikeskkonnas pole valke, jääb segu pruuniks, seega on selle metoodika abil nende makromolekulide olemasolu esmajärjekorras väga lihtne tuvastada.

Bradfordi meetodi keemilised alused

Oleme sisenemas veidi keerukamasse maastikku, sest on aeg kirjeldada, mis toimub nende molekulide vahel väljaspool otseseid värvimuutusi. Valguga liitumisel moodustab Coomassie sinine katioonilises ja topeltprononeeritud vormis (punane) nimetatud makromolekuliga väga tugeva mittekovalentse sideme., van der Waalsi jõudude ja elektrostaatiliste vastasmõjude abil.

Selle keemilise kompleksi moodustumise ajal annab värv valgu ioniseeritavad osad vaba elektron (pidage meeles, et katioon = positiivne laeng, kaotab elektrone), mis põhjustab valgu seisundi katkemist normaalne. See paljastab teatud ained, mis võivad tekitada varem kirjeldatud ametiühinguid, milles me ei kavatse nende keemilise keerukuse tõttu peatuda. Kokkuvõttes peate teadma ainult järgmist:

Punane värv (katioonne / valguga seondumata) ≠ Sinine värv (anioonne / valguga seotud)

Selle eelduse põhjal tuleb märkida, et punase värvaine neeldumisspekter on 465 nm, väärtus, mis tähistab langevat elektromagnetkiirgust, mida materjal neelab sagedusvahemikus. Anioonses sinises vormis (suheldes valkudega) toimub neeldumise muutus lainepikkusel 595 nm. Seetõttu tehakse Bradfordi meetodile allutatud lahuses spektrofotomeetrites näidu vahemikus 595 nm.

Neeldumise suurenemine selles spektris on otseselt proportsionaalne värvaine ja valkude vaheliste sidemete arvuga, seega Ainult tuvastatakse, et valke on koos värvimuutusega, kuid on võimalik hinnata ka seda, kui palju valku on milliliitris söötmes vedel. Uskumatu tõsi?

• Teile võivad huvi pakkuda: "Laborimaterjal: 23 olulist eset ja instrumenti"

Bradfordi meetodi protseduur

Selle metoodika läbiviimiseks on vajalik spektrofotomeeter, mis pole just odav (umbes 2000 eurot umbes), nii et seda pole võimalik kodust juhtida. See masin on võimeline projitseerima proovi kaudu monokromaatilise valgusvihu, et mõõta huvipakkuvate ühendite neelatava valguse hulka. Seega saab teadlane teavet kõnesolevas lahuses olevate molekulide olemuse kohta ja suudab muide arvutada ka nimetatud molekuli kontsentratsiooni.

Lisaks tuleb märkida, et reaktiiv ei ole lihtsalt "toores" Coomassie sinine. 100 milligrammi värvi tuleks lahustada 50 milliliitris 95% etanooli lahuses ja lisada 100 milliliitrit 85% fosforhapet. Peale selle on vaja lahjendada liitrini, kui värv on lahustunud, ja segu filtreerida, et saada meetodis kasutatud lõplik reaktiiv. Selle lahuse värv ilma valkudeta, nagu me oleme öelnud, peaks olema pruunikas.

Kui uurijal on olemas reagent ja spektrofotomeeter, peab ta järgima järgmisi samme:

• Valmistage ette spektrofotomeeter ja kontrollige selle õiget toimimist.
• Valmistage analüüsitav valgu lahus. Ideaalis peaks see proov sisaldama 5 kuni 100 mikrogrammi valku 100 mikroliitri kogu lahuse kohta. On ilmne, et täpne kontsentratsioon ei ole teada, kuid need on maksimaalsed ja minimaalsed väärtused.
• Valmistage ette standardid. Me ei kavatse nende eripära nende keemiliste komplikatsioonide tõttu süveneda.
• Lisage lahusele 5 milliliitrit reagenti ja laske sellel 5 minutit inkubeeruda.
• Mõõtke segu neelduvus spektrofotomeetril lainepikkusel 595 nm.

Tulemused ilmuvad spektrofotomeetri ekraanile ja uuringu läbiviija peaks selle märkima. Kui nad on seda teinud, on vaja luua graafik (kalibreerimiskõver), mille telgedel on kaks väärtust: neelduvus vs mikrogrammi valku. Väärtustega loodud kõvera põhjal saab neid ekstrapoleerida, et saada valgus täpne kontsentratsioon lahuses.

Eelis

Bradfordi meetodit on väga lihtne teostada kõigile, kes on seotud laboriväljaga, kuna iga bioloog ja keemik on vähemalt ühe õppeaasta jooksul silmitsi olnud spektrofotomeetriga aeg. Kas klorofülli koguse mõõtmiseks lehe purustamisel saadud lahuses (tüüpiline) palju keerukamate asjade jaoks on spektrofotomeetrid väga laialt levinud õppimine.

Lisaks oma lihtsusele Tuleb märkida, et paljudel nende looduslikus olekus valkude imendumisala on 280 nm juures äärmiselt madal. Isegi kõik valgud ei saavuta seda väärtust, sest selleks peavad neil olema spetsiifilised aminohapped (türosiin, fenüülalaniin ja trüptofaan), mida alati pole. Kuna see neeldumisnäitaja on UV-vahemikus, on vajalik spetsiaalne masin, mida peaaegu keegi ei pea neid ravima.

Tõesti, see, mida Bradfordi meetodil tehakse, on värviga seondumise abil proteiinide neeldumisväärtuse "suurendamine". Lisaks sellele, et valgud on sellises olekus palju paremini loetavad, eemalduvad valgud teiste bioloogiliste molekulide neeldumisspektritest, mis võivad proovi saastada.

Jätka

Selles väikeses keemiatunnis oleme sukeldunud ühte lihtsamasse ja lihtsamasse valgu kvantifitseerimise meetodisse, kui vastav materjal on olemas. Igal juhul peame rõhutama, et nagu kõik siin elus, pole see ka täiuslik ja eksimatu: tavaliselt on vaja teha mitu analüüsitava proovi lahjendused (minimaalsed ja maksimaalsed väärtused 0 µg / ml kuni 2000 µg / ml), mis võib põhjustada vigu protsess.

Lisaks võib detergentide ja muude ühendite olemasolu lahuses takistada meetodi õiget väljatöötamist. Õnneks on nende probleemide lahendamiseks paljudel juhtudel segule lisada muid reaktiive.

Bibliograafilised viited:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Värvivastuse ja interferentsi mehhanism Bradfordi valgu analüüsis. Analüütiline biokeemia, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Bradfordi valgutesti lineariseerimine. Visualiseeritud katsete ajakiri: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., ja Berlet, H. H. (1989). Bradfordi valgutesti tundlikkus ja varieeruvus detergentide juuresolekul. Analüütiline biokeemia, 178 (2), 263-268.
• Tema, F. (2011). Bradfordi valgu analüüs. Bioprotokoll, e45-e45.
• Jones, C. G., Jänes, J. D., & Compton, S. J. (1989). Taimsete valkude mõõtmine Bradfordi analüüsiga. Keemilise ökoloogia ajakiri, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Kollageenvalkude täiustatud Bradfordi valgu analüüs. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. ja Selinger, Z. (1996). Bradfordi valgutesti lineariseerimine suurendab selle tundlikkust: teoreetilised ja eksperimentaalsed uuringud. Analüütiline biokeemia, 236 (2), 302-308.