Metode Bradford: apa itu dan bagaimana cara kerjanya

Protein adalah makromolekul yang tersusun dari asam amino. Sekitar 500 asam amino yang berbeda telah dijelaskan di alam, tetapi anehnya, hanya 20 asam amino esensial yang ada dalam tubuh manusia. DNA mengandung semua informasi yang diperlukan untuk sintesis protein, karena melalui mekanisme transkripsi dan translasi, triplet nukleotida DNA diubah menjadi asam amino beton.

Ribosom adalah organel yang bertanggung jawab untuk merakit asam amino ini, sehingga menimbulkan rantai dengan urutan dan panjang yang bervariasi, atau yang sama, yang kita kenal sebagai protein. Biomolekul ini penting untuk memahami kehidupan, karena mereka menyumbang sekitar 80% dari protoplasma kering di setiap sel dan mewakili 50% dari berat di semua jaringan hidup.

Dengan data ini di tangan, lebih dari jelas bagi kita pentingnya protein dalam generasi kehidupan. Hari ini kami datang untuk membawa Anda mekanisme yang sangat menarik terkait dengan topik ini, karena kami akan memberi tahu Anda segalanya tentang Metode Bradford, dirancang untuk mengukur konsentrasi protein suatu larutan.

• Artikel terkait: "Apa itu metode ilmiah dan bagaimana cara kerjanya?"

Apa itu metode Bradford?

Metode Bradford (dikenal sebagai esai protein Bradfords dalam bahasa Inggris) dijelaskan, seperti namanya, oleh ilmuwan Amerika Marion Mckinley Bradford, pada tahun 1976. Pertama-tama, perlu ditekankan bahwa Ini adalah metode spektrometri, istilah yang mencakup serangkaian prosedur laboratorium berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit (komponen yang ingin Anda pisahkan dari matriks).

Selain itu, perlu dicatat bahwa ini adalah metode yang bersifat kolorimetri, yaitu: memperoleh hasil berdasarkan warna dan konsentrasinya dalam larutan tertentu. Kunci konglomerat terminologis ini ditemukan dalam pewarna "Coomassie blue", karena metode Bradford mengkuantifikasi perubahan absorbansinya menurut parameter tertentu. Pewarna ini tampak biru dalam bentuk anioniknya, hijau dalam bentuk netralnya, dan merah dalam bentuk kationiknya.

Dalam kondisi asam dalam larutan, Coomassie blue berubah dari merah menjadi biru dan, dalam prosesnya, berikatan dengan protein yang akan diukur. Jika tidak ada protein dalam media berair, campuran tetap berwarna coklat, sehingga sangat mudah untuk mendeteksi keberadaan makromolekul ini pada contoh pertama dengan metodologi ini.

Basa kimia dari metode Bradford

Kita memasuki medan yang sedikit lebih kompleks, karena inilah saatnya untuk menjelaskan apa yang terjadi di antara molekul-molekul ini di luar perubahan warna langsung. Ketika bergabung dengan protein, Coomassie blue dalam bentuk kationik dan terprotonasi ganda (merah) membentuk ikatan non-kovalen yang sangat kuat dengan makromolekul tersebut., oleh gaya van der waals dan interaksi elektrostatik.

Selama pembentukan kompleks kimia ini, pewarna menyumbang ke bagian protein yang dapat terionisasi elektron bebas (ingat bahwa kation = muatan positif, kehilangan elektron), yang menyebabkan gangguan pada keadaan protein normal. Ini mengekspos zat tertentu yang dapat menghasilkan serikat yang dijelaskan sebelumnya, di mana kita tidak akan berhenti karena kompleksitas kimianya. Singkatnya, Anda hanya perlu mengetahui hal-hal berikut:

Pewarna merah (kationik / tidak terikat protein) Pewarna biru (anionik / terikat protein)

Berdasarkan premis ini, perlu dicatat bahwa pewarna merah memiliki spektrum serapan 465 nm, nilai yang mewakili radiasi elektromagnetik insiden yang diserap bahan dalam rentang frekuensi. Dalam bentuk biru anionik (berinteraksi dengan protein), perubahan penyerapan terjadi pada 595 nm. Oleh karena itu, dalam larutan yang dikenai metode Bradford, pembacaan dilakukan dalam spektrofotometer pada kisaran 595 nm.

Peningkatan absorbansi pada spektrum ini berbanding lurus dengan jumlah ikatan antara zat warna dan protein, sehingga tidak Hanya terdeteksi bahwa ada protein dengan perubahan warna, tetapi juga memungkinkan untuk memperkirakan berapa banyak protein yang ada per mililiter medium. cair. Luar biasa benar?

• Anda mungkin tertarik pada: "Materi laboratorium: 23 benda dan instrumen penting"

Prosedur metode Bradford

Untuk melakukan metodologi ini, diperlukan spektrofotometer, yang tidak bisa dibilang murah (sekitar 2.000 euro), jadi itu bukan sesuatu yang bisa dijalankan dari rumah.. Mesin ini mampu memproyeksikan berkas cahaya monokromatik melalui sampel, untuk mengukur jumlah cahaya yang diserap oleh senyawa yang diinginkan. Dengan demikian, peneliti menerima informasi tentang sifat molekul dalam larutan yang bersangkutan dan, kebetulan, juga dapat menghitung konsentrasi molekul tersebut.

Selanjutnya, perlu dicatat bahwa reagen tidak hanya biru Coomassie "mentah". 100 miligram pewarna harus dilarutkan dalam 50 mililiter larutan etanol 95% dan 100 mililiter asam fosfat 85% ditambahkan. Selain itu, perlu untuk mengencerkannya menjadi satu liter setelah pewarna larut dan menyaring campuran, untuk menghasilkan reagen definitif yang digunakan dalam metode ini. Warna larutan ini tanpa protein, seperti yang telah kami katakan, seharusnya kecoklatan.

Setelah peneliti memiliki reagen dan spektrofotometer, ia harus mengikuti langkah-langkah berikut:

• Siapkan spektrofotometer dan periksa operasinya yang benar.
• Siapkan larutan protein yang akan dianalisis. Idealnya, sampel ini harus mengandung antara 5 dan 100 mikrogram protein per 100 mikroliter larutan total. Jelas bahwa konsentrasi yang tepat tidak diketahui, tetapi mereka adalah nilai maksimum dan minimum.
• Siapkan standar. Kami tidak akan membahas kekhasan mereka karena komplikasi kimia yang ditimbulkannya.
• Tambahkan 5 mililiter reagen ke dalam larutan dan biarkan diinkubasi selama 5 menit.
• Ukur absorbansi campuran pada spektrofotometer pada 595 nm.

Hasilnya akan muncul di layar spektrofotometer, dan harus dicatat oleh profesional yang melakukan penyelidikan. Begitu mereka punya, perlu untuk membuat grafik (kurva kalibrasi) yang menghadapi dua nilai pada sumbunya: absorbansi vs mikrogram protein. Dari kurva yang dihasilkan dengan nilai, ini dapat diekstrapolasi untuk mendapatkan konsentrasi protein yang tepat dalam larutan.

Keuntungan

Metode Bradford sangat mudah dilakukan bagi siapa saja yang berhubungan dengan bidang laboratorium, karena setiap ahli biologi dan ahli kimia telah menghadapi spektrofotometer selama tahun-tahun studinya setidaknya satu waktu. Entah untuk mengukur jumlah klorofil dalam larutan dari penghancuran daun (khas) untuk hal-hal yang jauh lebih kompleks, spektrofotometer sangat tersebar luas di bidang belajar.

Selain kemudahannya, Perlu dicatat bahwa banyak protein dalam keadaan alaminya memiliki rentang penyerapan yang sangat rendah, pada 280 nm .. Bahkan tidak semua protein mencapai nilai ini, karena untuk ini mereka harus memiliki asam amino spesifik (tirosin, fenilalanin, dan triptofan), yang tidak selalu ada. Karena angka absorbansi ini berada dalam kisaran UV, diperlukan mesin khusus yang hampir tidak ada orang yang merawatnya.

Betulkah, apa yang dilakukan dalam metode Bradford adalah untuk "meningkatkan" nilai absorbansi protein dengan mengikat pewarna. Selain menjadi lebih mudah dibaca dalam keadaan ini, protein menjauh dari spektrum absorbansi molekul biologis lainnya, yang dapat mencemari sampel.

Lanjut

Di kelas kimia kecil ini, kami telah membenamkan diri dalam salah satu metode kuantifikasi protein paling sederhana dan termudah untuk dilakukan, asalkan bahan yang relevan tersedia. Bagaimanapun, kita harus menekankan bahwa, seperti segala sesuatu dalam hidup ini, itu juga tidak sempurna dan sempurna: biasanya diperlukan untuk membuat beberapa pengenceran sampel untuk analisis (nilai minimum dan maksimum 0 g / mL hingga 2000 g / mL), yang dapat menyebabkan kesalahan selama proses.

Selain itu, keberadaan deterjen dan senyawa lain dalam larutan dapat mencegah pengembangan metode yang benar. Untungnya, ada reagen lain yang dapat ditambahkan ke dalam campuran untuk memecahkan masalah ini dalam banyak kasus.

Referensi bibliografi:

• Compton, S. J., & Jones, C. G (1985). Mekanisme respon pewarna dan interferensi dalam uji protein Bradford. Biokimia analitik, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Linearisasi uji protein Bradford. Jurnal eksperimen yang divisualisasikan: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H (1989). Sensitivitas dan variabilitas uji protein Bradford dengan adanya deterjen. Biokimia analitik, 178 (2), 263-268.
• Dia, F (2011). uji protein Bradford. Bio-protokol, e45-e45.
• Jones, C. G., Kelinci, J. D., & Compton, S. J (1989). Mengukur protein nabati dengan uji Bradford. Jurnal ekologi kimia, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Uji protein Bradford yang ditingkatkan untuk protein kolagen. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearisasi uji protein Bradford meningkatkan sensitivitasnya: studi teoretis dan eksperimental. Biokimia analitik, 236 (2), 302-308.