שיטת ברדפורד: מה זה ואיך זה עובד

חלבונים הם מקרומולקולות המורכבות מחומצות אמינו. כ -500 חומצות אמינו שונות תוארו בטבע, אך באופן מוזר, רק 20 הן החיוניות הקיימות בגוף האדם. ה- DNA מכיל את כל המידע הדרוש לסינתזת חלבון, מאז דרך מנגנוני תעתיק ותרגום, שלישת נוקלאוטידים של DNA מומרת לחומצת אמינו בֵּטוֹן.

הריבוזומים הם האברונים האחראים להרכבת חומצות אמינו אלה, מה שמוליד שרשראות בעלות סדר ואורך משתנה, או מה זהה, מה שאנחנו מכירים כחלבונים. ביומולקולות אלה חיוניות להריון חיים, מכיוון שהן מהוות כ 80% מהפרוטופלזמה היבשה בכל תא ומייצגות 50% מהמשקל בכל הרקמות החיות.

עם נתונים אלה ביד, ברור לנו יותר מחשיבותם של חלבונים בדור החיים. היום אנו באים להביא לכם מנגנון מעניין מאוד הקשור לנושא זה, כי נספר לכם הכל עליו השיטה של ​​ברדפורד, שנועד לכמת את ריכוז החלבון של תמיסה.

• מאמר קשור: "מהי השיטה המדעית ואיך היא עובדת?"

מהי שיטת ברדפורד?

שיטת ברדפורד (המכונה מאמר חלבונים של ברדפורדס באנגלית) תוארה, כפי ששמה מרמז, על ידי המדען האמריקני מריון מקינלי ברדפורד, בשנת 1976. קודם כל, יש צורך להדגיש זאת זוהי שיטה ספקטרומטרית, מונח המקיף מערך נהלי מעבדה המבוסס על האינטראקציה של קרינה אלקטרומגנטית עם אנליטית. (רכיב העניין שברצונך להפריד בין המטריצה).

בנוסף לכך, יש לציין כי מדובר בשיטה בעלת אופי קולורימטרי, כלומר משיג תוצאות על בסיס צבעים וריכוזם בפתרון ספציפי. המפתח לקונגלומרט טרמינולוגי זה נמצא בצבע "Coomassie blue", מכיוון ששיטת ברדפורד מכמתת את שינויים בספיגתו על פי פרמטרים מסוימים. צבע זה נראה כחול בצורתו האניונית, ירוק בצורתו הנייטרלית, ואדום בצורתו הקטיונית.

בתנאים חומציים בתמיסה, כחול הקומאסי הופך מאדום לכחול ובתוך כך נקשר לחלבונים שיש לכמת. אם אין חלבונים במדיום המימי, התערובת נותרת חומה, ולכן קל מאוד לזהות את נוכחותם של מקרומולקולות אלה בשלב הראשון באמצעות מתודולוגיה זו.

הבסיסים הכימיים של שיטת ברדפורד

אנו נכנסים לשטח מורכב מעט יותר, מכיוון שהגיע הזמן לתאר מה קורה בין המולקולות הללו מעבר לשינויים ישירים בצבע. כאשר מצטרפים לחלבון, כחול הקומאסי בצורתו הפרוטונית הקטיונית והכפולה (אדום) יוצר קשר לא קוולנטי חזק מאוד עם מקרומולקולה האמורה., מאת כוחות ואן דר וואלס ואינטראקציות אלקטרוסטטיות.

במהלך היווצרות קומפלקס כימי זה, הצבע נותן לחלקים הניתנים ליינון של החלבון את זה אלקטרון חופשי (זכרו שקטיון = מטען חיובי, מאבד אלקטרונים), הגורם להפרעה במצב החלבון נוֹרמָלִי. זה חושף חומרים מסוימים שעשויים ליצור את האיחודים שתוארו בעבר, בהם אנחנו לא הולכים לעצור בגלל המורכבות הכימית שלהם. לסיכום, עליכם לדעת רק את הדברים הבאים:

צבע אדום (קטיוני / לא קשור לחלבון) ≠ צבע כחול (אניוני / קשור לחלבון)

על סמך הנחת יסוד זו, יש לציין כי לצבע האדום ספקטרום ספיגה של 465 ננומטר, ערך המייצג את הקרינה האלקטרומגנטית המתקיימת שחומר סופג בטווח תדרים. בצורה כחולה אניונית (אינטראקציה עם חלבונים), שינוי ספיגה מתרחש ב 595 ננומטר. לכן, בפתרון הנתון לשיטת ברדפורד, הקריאות נעשות בספקטרופוטומטרים בטווח של 595 ננומטר.

עליית הספיגה בספקטרום זה פרופורציונלית ישירות למספר הקשרים בין הצבע לחלבונים, כך שהיא אינה מתגלה רק שישנם חלבונים עם שינוי הצבע, אך ניתן גם להעריך כמה חלבונים יש למיליליטר בינוני. נוזל. נכון לא ייאמן?

• אתה עשוי להתעניין ב: "חומר מעבדה: 23 עצמים ומכשירים חיוניים"

נוהל שיטת ברדפורד

על מנת לבצע מתודולוגיה זו יש צורך בספקטרופוטומטר שאינו זול בדיוק (כ -2,000 אירו), ולכן אין זה דבר שניתן להריץ מהבית.. מכונה זו מסוגלת להקרין אלומת אור מונוכרומטית דרך דגימה על מנת למדוד את כמות האור הנספגת בתרכובות מעניינות. לפיכך, החוקר מקבל מידע על טיבן של המולקולות בתמיסה המדוברת, ואגב כך הוא גם מסוגל לחשב את ריכוז המולקולה האמורה.

יתר על כן, יש לציין כי המגיב אינו רק כחול קומומסי "גולמי". 100 מיליגרם של הצבע צריך להיות מומס ב 50 מיליליטר של תמיסת אתנול 95% ו 100 מיליליטר של 85% חומצה זרחתית להוסיף. בנוסף, יש צורך לדלל אותו לליטר אחד לאחר שהחומר הצומח מומס ולסנן את התערובת, כדי ליצור ריאגנט סופי המשמש בשיטה. הצבע של תמיסה זו ללא חלבונים קיימים, כפי שאמרנו, צריך להיות חום.

ברגע שלחוקר יש את המגיב ואת הספקטרופוטומטר, עליו לבצע את הצעדים הבאים:

• הכן את הספקטרופוטומטר ובדוק את פעולתו הנכונה.
• הכן את תמיסת החלבון לניתוח. באופן אידיאלי, מדגם זה אמור להכיל בין 5 ל- 100 מיקרוגרם חלבון לכל 100 מיקרוליטר של תמיסה כוללת. ברור שהריכוז המדויק אינו ידוע, אך הם הערכים המקסימליים והמינימליים.
• הכן סטנדרטים. אנחנו לא הולכים להיכנס למיוחדות שלהם בגלל הסיבוך הכימי שהם גוררים.
• הוסף 5 מיליליטר של ריאגנט לתמיסה ואפשר לו לדגור במשך 5 דקות.
• מדוד את הספיגה של התערובת על הספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר.

התוצאות יופיעו על גבי מסך הספקטרופוטומטר, ויש לציין זאת על ידי איש המקצוע שמבצע את המחקר. ברגע שיש להם, יש צורך ליצור גרף (עקומת כיול) הפונה לשני ערכים על ציריהם: ספיגה לעומת מיקרוגרם חלבון. מהעקומה שנוצרה עם הערכים, ניתן להפיץ אותם כדי להשיג את הריכוז המדויק של החלבון בתמיסה.

יתרון

שיטת ברדפורד קלה מאוד לביצוע לכל מי שקשור לתחום המעבדה, מכיוון שכל ביולוג וכימאי התמודד עם ספקטרופוטומטר אחד לפחות במהלך שנות המחקר שלהם זְמַן. או כדי למדוד את כמות הכלורופיל בתמיסה מכתישת עלה (אופייני) לדברים מורכבים הרבה יותר, ספקטרופוטומטרים נפוצים מאוד בתחומי לְמִידָה.

בנוסף לקלות שלה, יש לציין כי חלבונים רבים במצבם הטבעי הם בעלי טווח ספיגה נמוך במיוחד, ב -280 ננומטר. אפילו לא כל החלבונים מגיעים לערך זה, מכיוון שבשביל זה עליהם להיות בעלי חומצות אמינו ספציפיות (טירוזין, פנילאלנין וטריפטופן), שאינן תמיד קיימות. מכיוון שנתון הספיגה הזה נמצא בתחום ה- UV, יש צורך במכונה מיוחדת שאין כמעט לאף אחד כדי שתוכל לטפל בהם.

בֶּאֱמֶת, מה שנעשה בשיטת ברדפורד הוא "להגדיל" את ערך הספיגה של חלבונים על ידי קשירה לצבע. בנוסף להיותם הרבה יותר קלים לקריאה במצב זה, החלבונים מתרחקים מספקטרום הספיגה של מולקולות ביולוגיות אחרות, העלולות לזהם את הדגימה.

קורות חיים

בשיעור כימיה קטן זה, שקענו באחת מהשיטות הפשוטות והכי קלות ביותר של כימות חלבונים לביצוע, בתנאי שהחומר הרלוונטי זמין. בכל מקרה, עלינו להדגיש שכמו כל דבר בחיים אלה, הוא גם לא מושלם ובלתי טעים: בדרך כלל יש צורך ליצור מספר רב של דברים דילולים של המדגם לניתוח (ערכים מינימליים ומקסימליים של 0 µg / mL עד 2000 µg / mL), מה שעלול להוביל לשגיאות במהלך התהליך.

יתר על כן, נוכחותם של חומרי ניקוי ותרכובות אחרות בתמיסה יכולה למנוע התפתחות נכונה של השיטה. למרבה המזל, ישנם ריאגנטים אחרים שניתן להוסיף לתערובת כדי לפתור בעיות אלה במקרים רבים.

הפניות ביבליוגרפיות:

• קומפטון, ש. ג'יי וג'ונס, ג. ז. (1985). מנגנון של תגובת צבע והפרעה בבדיקת החלבון ברדפורד. ביוכימיה אנליטית, 151 (2), 369-374.
• ארנסט, או., וזור, ט. (2010). לינאריה של בדיקת החלבון ברדפורד. כתב העת לניסויים מדומים: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. ח. (1989). רגישות ושונות של בדיקת החלבון ברדפורד בנוכחות חומרי ניקוי. ביוכימיה אנליטית, 178 (2), 263-268.
• הוא, פ. (2011). בדיקת חלבון ברדפורד. פרוטוקול ביו, e45-e45.
• ג'ונס, ג. ג ', האר, ג'יי ד ', וקומפטון, ס. י. (1989). מדידת חלבון מהצומח בעזרת assay ברדפורד. כתב העת לאקולוגיה כימית, 15 (3), 979-992.
• לופז, ג ', אימפריאל, ס', ולדרמה, ר ', ונבארו, ס. (1993). בדיקת חלבון ברדפורד משופרת לחלבוני קולגן. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• זור, ט. וסלינגר, ז. (1996). לינאריזציה של בדיקת החלבון ברדפורד מגבירה את הרגישות שלו: מחקרים תיאורטיים וניסיוניים. ביוכימיה אנליטית, 236 (2), 302-308.