ბრედფორდის მეთოდი: რა არის ეს და როგორ მუშაობს

ცილები არის მაკრომოლეკულები, რომლებიც ამინომჟავებისგან შედგება. ბუნებაში აღწერილია 500 – მდე სხვადასხვა ამინომჟავა, მაგრამ საინტერესოა, რომ ადამიანის ორგანიზმში მხოლოდ 20 არის მნიშვნელოვანი. დნმ შეიცავს ყველა ინფორმაციას, რომელიც აუცილებელია ცილის სინთეზირებისთვის, მას შემდეგ ტრანსკრიფციისა და თარგმნის მექანიზმები, დნმ ნუკლეოტიდების სამეული გარდაიქმნება ამინომჟავად ბეტონის.

რიბოსომები არის ორგანოელები, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან ამ ამინომჟავების აწყობაზე, წარმოქმნიან ჯაჭვებს ბრძანებებით და ცვლადი სიგრძით, ან რა არის იგივე, რასაც ჩვენ ცილებს ვუწოდებთ. ეს ბიომოლეკულები აუცილებელია სიცოცხლის წარმოსადგენად, რადგან მათ შეადგენს მშრალი პროტოპლაზმის დაახლოებით 80% ყველა უჯრედში და წარმოადგენს წონის 50% ყველა ცოცხალ ქსოვილში.

ამ მონაცემების ხელთ, ჩვენზე მეტად ნათელია ცილების მნიშვნელობა სიცოცხლის თაობაში. დღეს ჩვენ მოვედით ამ თემასთან დაკავშირებით ძალიან საინტერესო მექანიზმი მოგიტანოთ, რადგან ჩვენ ყველაფერს მოგიყვებით ბრედფორდის მეთოდი, შექმნილია ხსნარის ცილის კონცენტრაციის დასადგენად.

დაკავშირებული სტატია: ”რა არის სამეცნიერო მეთოდი და როგორ მუშაობს იგი?”

instagram story viewer

რა არის ბრედფორდის მეთოდი?

ბრედფორდის მეთოდი (ინგლისურად ცნობილი როგორც ბრედფორდსის ცილის ესე) აღწერილი იქნა, როგორც მისი სახელიდან ჩანს, ამერიკელმა მეცნიერმა მარიონ მაკინლი ბრედფორდმა, 1976 წელს. უპირველეს ყოვლისა, აუცილებელია იმის ხაზგასმა ეს არის სპექტრომეტრიული მეთოდი, ტერმინი, რომელიც მოიცავს ლაბორატორიულ პროცედურებს, რომლებიც ეფუძნება ელექტრომაგნიტური გამოსხივების ურთიერთქმედებას ანალიზთან (ინტერესის კომპონენტი, რომლის გამოყოფა გსურთ მატრიცისგან).

ამას გარდა, უნდა აღინიშნოს, რომ ეს არის კოლორიმეტრიული ხასიათის მეთოდი, ანუ ის იღებს შედეგებს ფერების და მათი კონცენტრაციის საფუძველზე სპეციფიკურ ხსნარში. ამ ტერმინოლოგიური კონგლომერატის გასაღები გვხვდება "Coomassie blue" საღებავში, ვინაიდან ბრედფორდის მეთოდით ხდება მისი შთანთქმის ცვლილებების რაოდენობრივი განსაზღვრა გარკვეული პარამეტრების მიხედვით. ეს საღებავი ანიონური ფორმით ლურჯი ჩანს, ნეიტრალური სახით მწვანე და კატიონური ფორმით წითელი.

ხსნარში მჟავე პირობებში, Coomassie ლურჯი წითელიდან ლურჯად იქცევა და, ამ პროცესში, უკავშირდება რაოდენობრივად განსაზღვრულ ცილებს. თუ წყალში არ არის ცილები, ნარევი ყავისფერი რჩება, ამიტომ ამ მეთოდით ძალიან ადვილია ამ მაკრომოლეკულების არსებობის დადგენა.

ბრედფორდის მეთოდის ქიმიური საფუძვლები

ჩვენ ცოტა უფრო რთულ რელიეფში შევდივართ, რადგან დროა აღვწეროთ რა ხდება ამ მოლეკულებს შორის პირდაპირი ფერის ცვლილებების მიღმა. ცილასთან შეერთებისას, Coomassie blue თავისი კატიონური და ორმაგი პროტონირებული ფორმით (წითელი) ქმნის ძლიერ არაკოვალენტურ კავშირს ხსენებულ მაკრომოლეკულასთან., ვან დერ უოლის ძალებისა და ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების შედეგად.

ამ ქიმიური კომპლექსის ფორმირების დროს საღებავი აძლევს ცილის მაიონიზირებელ ნაწილებს თავისუფალი ელექტრონი (გახსოვდეთ, რომ კათიონი = პოზიტიური მუხტი კარგავს ელექტრონებს), რაც იწვევს ცილების მდგომარეობის მოშლას ნორმალური ეს ავლენს გარკვეულ ნივთიერებებს, რომლებმაც შეიძლება წარმოქმნან ადრე აღწერილი გაერთიანებები, რომელთა შეჩერებას არ ვაპირებთ მათი ქიმიური სირთულის გამო. შემაჯამებელი, თქვენ მხოლოდ უნდა იცოდეთ შემდეგი:

წითელი საღებავი (კატიონური / არ უკავშირდება ცილებს) ≠ ლურჯი საღებავი (ანიონური / უკავშირდება ცილებს)

ამ წინაპირობის საფუძველზე უნდა აღინიშნოს, რომ წითელი საღებავი აქვს შთანთქმის სპექტრი 465 ნმ, მნიშვნელობა წარმოადგენს ინციდენტურ ელექტრომაგნიტურ გამოსხივებას, რომელსაც მასალა შთანთქავს სიხშირეების დიაპაზონში. ანიონური ლურჯი ფორმით (ურთიერთქმედება ცილებთან), შთანთქმის ცვლილება ხდება 595 ნმ-ზე. ამიტომ, ბრედფორდის მეთოდს დაქვემდებარებულ ხსნარში იკითხება სპექტროფოტომეტრები 595 ნმ დიაპაზონში.

ამ სპექტრში აბსორბციის ზრდა პირდაპირპროპორციულია საღებავსა და ცილებს შორის ბმების რაოდენობის შესაბამისად, ამიტომ იგი არ მხოლოდ ის არის გამოვლენილი, რომ არსებობს ცილები ფერის შეცვლით, მაგრამ ასევე შესაძლებელია შეფასდეს რამდენია ცილა საშუალო მილილიტრში თხევადი წარმოუდგენელი მართალია?

შეიძლება დაგაინტერესოთ: "ლაბორატორიული მასალა: 23 აუცილებელი ობიექტი და ინსტრუმენტი"

ბრედფორდის მეთოდის პროცედურა

ამ მეთოდოლოგიის განსახორციელებლად აუცილებელია სპექტროფოტომეტრი, რომელიც არ არის ზუსტად იაფი (დაახლოებით 2,000 ევრო), ამიტომ სახლიდან გაყვანა არ არის. ამ მანქანას შეუძლია შუქის მონოქრომატული სხივის დაპროექტება ნიმუშის საშუალებით, რათა გაზომოს სინათლის რაოდენობა, რომელიც შეიწოვება საინტერესო ნაერთების მიერ. ამრიგად, მკვლევარი იღებს ინფორმაციას მოცემულ ხსნარში მოლეკულების ბუნების შესახებ და, სხვათა შორის, ასევე შეუძლია გამოთვალოს აღნიშნული მოლეკულის კონცენტრაცია.

გარდა ამისა, უნდა აღინიშნოს, რომ რეაგენტი არ არის მხოლოდ "ნედლი" Coomassie blue. 100 მილიგრამი საღებავი უნდა დაიხსნას 50 მილილიტრში 95% ეთანოლის ხსნარში და 100 მლ 85% ფოსფორმჟავას. გარდა ამისა, საჭიროა მისი გაჟონვა ლიტრამდე მას შემდეგ, რაც საღებავი დაიშალა და მოხდება ნარევის გაფილტვრა, რათა წარმოიშვას საბოლოო რეაგენტი, რომელიც გამოიყენება ამ მეთოდით. ამ ხსნარის ფერი ცილების გარეშე, როგორც ვთქვით, უნდა იყოს მოყავისფრო.

მას შემდეგ, რაც მკვლევარს რეაგენტი და სპექტროფოტომეტრი აქვს, მან უნდა დაიცვას შემდეგი ნაბიჯები:

მოამზადეთ სპექტროფოტომეტრი და შეამოწმეთ მისი სწორი მოქმედება.
მოამზადეთ გასაანალიზებელი ცილის ხსნარი. იდეალურ შემთხვევაში, ეს ნიმუში უნდა შეიცავდეს 5-დან 100 მიკროგრამამდე ცილას 100 მიკროლიტრ საერთო ხსნარში. აშკარაა, რომ ზუსტი კონცენტრაცია არ არის ცნობილი, მაგრამ ისინი მაქსიმალური და მინიმალური მნიშვნელობებია.
სტანდარტების მომზადება. ჩვენ არ ვაპირებთ მათ თავისებურებებს გავეცნოთ მათ მიერ გამოწვეული ქიმიური გართულების გამო.
ხსნარს დაამატეთ 5 მილილიტრი რეაგენტი და გააჩერეთ ინკუბაცია 5 წუთის განმავლობაში.
გაზომეთ ნარევის აბსორბცია სპექტროფოტომეტრზე 595 ნმ-ზე.

შედეგები გამოჩნდება სპექტროფოტომეტრის ეკრანზე და უნდა აღნიშნოს პროფესიონალმა, რომელიც აწარმოებს გამოძიებას. ერთხელ მათ აქვთ, აუცილებელია გრაფიკის (კალიბრაციის მრუდის) შექმნა, რომელიც წინა ღერძზე ორ მნიშვნელობას აწყდება: შთანთქმის და ცილის მიკროგრამების. მნიშვნელობებით წარმოქმნილი მრუდიდან შესაძლებელია მათი ექსტრაპოლიზაცია, რათა მიიღონ ცილის ზუსტი კონცენტრაცია ხსნარში.

უპირატესობა

ბრედფორდის მეთოდი ძალიან მარტივია შესასრულებლად, ვინც ლაბორატორიულ სფეროს ეხება, მას შემდეგ, რაც ყველა ბიოლოგი და ქიმიკოსი წინაშე აღმოჩნდა სპექტროფოტომეტრი, სწავლის განმავლობაში, სულ მცირე, ერთი დრო ან გაზომეთ ქლოროფილის რაოდენობა ხსნარში ფოთლის გამანადგურებელიდან (ტიპიური) ბევრად უფრო რთულ ნივთებზე, სპექტროფოტომეტრი ძალიან ფართოდ არის გავრცელებული სწავლა.

გარდა ამისა, მისი მარტივია, უნდა აღინიშნოს, რომ ბევრ ბუნებრივ მდგომარეობაში მყოფ ცილებს აქვთ ძალიან დაბალი შთანთქმის დიაპაზონი, 280 ნმ. ყველა ცილა კი არ აღწევს ამ მნიშვნელობას, რადგან ამისათვის მათ უნდა ჰქონდეთ სპეციფიკური ამინომჟავები (ტიროზინი, ფენილალანინი და ტრიპტოფანი), რომლებიც ყოველთვის არ არის. ვინაიდან ეს შთანთქმის მაჩვენებელი UV დიაპაზონშია, საჭიროა სპეციალური მანქანა, რომელსაც თითქმის არავინ უწევს მკურნალობა.

ნამდვილად, რა ხდება ბრედფორდის მეთოდით, არის ცილების შეწოვის მნიშვნელობის "გაზრდა" საღებავთან შეერთებით. გარდა იმისა, რომ ამ მდგომარეობაში კითხვა ბევრად უფრო ადვილია, ცილები შორდებიან სხვა ბიოლოგიური მოლეკულების აბსორბციის სპექტრს, რამაც შეიძლება დააბინძუროს ნიმუში.

Გაგრძელება

ამ პატარა ქიმიის კლასში ჩავერთეთ ცილის რაოდენობრივი შეფასების ერთ-ერთ უმარტივეს და მარტივ მეთოდში, შესაბამისი მასალის არსებობის პირობით. ნებისმიერ შემთხვევაში, ჩვენ ხაზგასმით უნდა აღვნიშნოთ, რომ ისევე როგორც ყველაფერი ამ ცხოვრებაში, არც ის არის სრულყოფილი და უტყუარი: ჩვეულებრივ საჭიროა მრავალჯერადი ნიმუშის განზავება ანალიზისთვის (მინიმალური და მაქსიმალური მნიშვნელობები 0 მკგ / მლ-დან 2000 მკგ / მლ-მდე), რამაც შეიძლება შეცდომები გამოიწვიოს პროცესი.

გარდა ამისა, სარეცხი და სხვა ნაერთების არსებობა ხსნარში ხელს უშლის მეთოდის სწორად განვითარებას. საბედნიეროდ, არსებობს სხვა რეაგენტები, რომელთა დამატება შეიძლება ამ პრობლემების გადასაჭრელად, ხშირ შემთხვევაში.

ბიბლიოგრაფიული ცნობარი:

კომპტონი, ს. ჯ., და ჯონსი, ც. გ. (1985). საღებავების რეაგირებისა და ბრედფორდის ცილის ანალიზში ჩარევის მექანიზმი. ანალიტიკური ბიოქიმია, 151 (2), 369-374.
ერნსტ, ო., და ზორი, თ. (2010). ბრედფორდის ცილის ანალიზის ხაზოვანი გაყვანა. ვიზუალიზებული ექსპერიმენტების ჟურნალი: JoVE, (38).
Friedenauer, S., & Berlet, H. ჰ. (1989). ბრედფორდის ცილის ანალიზის მგრძნობელობა და ცვალებადობა სარეცხი საშუალებების თანდასწრებით. ანალიტიკური ბიოქიმია, 178 (2), 263-268.
მან, ფ. (2011). ბრედფორდის ცილის ანალიზი. ბიოპროტოკოლი, e45-e45.
ჯონსი, ც. გ., კურდღელი, ჯ. D., & Compton, S. ჯ. (1989). მცენარეული ცილის გაზომვა ბრედფორდის ანალიზით. ქიმიური ეკოლოგიის ჟურნალი, 15 (3), 979-992.
López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). კოლაგენის ცილების გაუმჯობესებული ბრედფორდის ცილის ანალიზი. კლინიკა ქიმიკა აქტა, 220 (1), 91-100.
Zor, T., & Selinger, Z. (1996). ბრედფორდის ცილის ანალიზის ხაზოვანი მოზრდილობა ზრდის მის მგრძნობელობას: თეორიული და ექსპერიმენტული კვლევები. ანალიტიკური ბიოქიმია, 236 (2), 302-308.