Bradford 방법: 그것이 무엇이며 어떻게 작동합니까?

단백질은 아미노산으로 구성된 거대 분자입니다. 약 500가지 다른 아미노산이 자연에 기술되어 있지만 이상하게도 인체에 존재하는 필수 아미노산은 20가지뿐입니다. DNA에는 단백질 합성에 필요한 모든 정보가 포함되어 있습니다. 전사 및 번역 메커니즘, DNA 뉴클레오티드의 삼중항이 아미노산으로 전환 콘크리트.

리보솜은 이러한 아미노산을 조립하는 역할을 하는 소기관으로, 순서와 길이가 다양한 사슬을 생성합니다. 이 생체 분자는 모든 세포에서 건조 원형질의 약 80%를 차지하고 모든 살아있는 조직에서 무게의 50%를 차지하기 때문에 생명을 잉태하는 데 필수적입니다.

이러한 데이터를 통해 생명 생성에 있어 단백질의 중요성이 더욱 분명해집니다. 오늘 우리는 이 주제와 관련된 매우 흥미로운 메커니즘을 가져오려고 합니다. 브래드포드의 방법, 용액의 단백질 농도를 정량화하도록 설계되었습니다.

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브래드포드 방식이란?

Bradford 방법(영어로 Bradfords 단백질 에세이로 알려짐)은 이름에서 알 수 있듯이 1976년 미국 과학자 Marion Mckinley Bradford에 의해 설명되었습니다. 우선 강조할 필요가 있다. 분광법은 분석 물질과 전자기 복사의 상호 작용을 기반으로 하는 일련의 실험실 절차를 포함하는 용어입니다. (행렬에서 분리하려는 관심 구성요소).

이 외에도 비색 특성의 방법, 즉 특정 솔루션에서 색상과 농도를 기반으로 결과를 얻습니다.. Bradford 방법이 특정 매개변수에 따라 흡광도의 변화를 정량화하기 때문에 이 용어집의 핵심은 "Coomassie blue" 염료에서 찾을 수 있습니다. 이 염료는 음이온 형태에서는 파란색, 중성 형태에서는 녹색, 양이온 형태에서는 빨간색으로 나타납니다.

용액의 산성 조건에서 Coomassie blue는 빨간색에서 파란색으로 변하고 그 과정에서 정량할 단백질에 결합합니다. 수성 매질에 단백질이 없는 경우 혼합물은 갈색으로 남아 있으므로 이 방법을 사용하면 처음에 이러한 거대분자의 존재를 감지하는 것이 매우 쉽습니다.

Bradford 방법의 화학 염기

직접적인 색상 변화를 넘어 이 분자들 사이에서 일어나는 일을 설명할 시간이기 때문에 우리는 조금 더 복잡한 지형으로 진입하고 있습니다. 단백질과 결합할 때 양이온 및 이중 양성자 형태(빨간색)의 쿠마시 블루는 상기 거대분자와 매우 강한 비공유 결합을 형성합니다., 반 데르 발스 힘과 정전기 상호 작용에 의해.

이 화학 복합체가 형성되는 동안 염료는 단백질의 이온화 가능한 부분에 제공됩니다. 자유 전자(양이온 = 양전하, 전자 손실), 단백질 상태 파괴 표준. 이것은 앞에서 설명한 결합을 생성할 수 있는 특정 물질을 노출시키며, 화학적 복잡성으로 인해 중단하지 않을 것입니다. 요약하면 다음 사항만 알면 됩니다.

적색 염료(양이온성/단백질 결합 안 됨) ≠ 청색 염료(음이온성/단백질 결합)

이러한 전제를 바탕으로 다음과 같은 사실에 주목해야 한다. 적색 염료는 465 nm의 흡수 스펙트럼을 가지며, 이는 물질이 주파수 범위 내에서 흡수하는 입사 전자기 복사를 나타내는 값입니다.. 음이온성 청색 형태(단백질과 상호작용)에서 흡수의 변화는 595 nm에서 발생합니다. 따라서 Bradford 방법을 적용한 용액에서 595 nm 범위의 분광 광도계에서 판독이 이루어집니다.

이 스펙트럼에서 흡광도의 증가는 염료와 단백질 사이의 결합 수에 정비례하므로 색이 변하는 단백질만 검출되지만 배지 1밀리리터당 단백질의 양을 추정하는 것도 가능합니다. 액체. 놀라운 사실?

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브래드포드 방법 절차

이 방법론을 수행하려면 분광 광도계가 필요하며 이는 정확히 저렴하지 않으므로(약 2,000유로) 집에서 실행할 수 있는 것이 아닙니다.. 이 기계는 관심 화합물에 의해 흡수되는 빛의 양을 측정하기 위해 샘플을 통해 단색 광선을 투사할 수 있습니다. 따라서 연구원은 해당 용액의 분자 특성에 대한 정보를 수신하고 부수적으로 해당 분자의 농도를 계산할 수도 있습니다.

또한 시약이 "원시" Coomassie blue가 아니라는 점에 유의해야 합니다. 염료 100밀리그램을 95% 에탄올 용액 50밀리리터에 녹이고 85% 인산 100밀리리터를 첨가해야 합니다. 또한 염료가 용해되면 1리터로 희석하고 혼합물을 여과하여 이 방법에 사용되는 최종 시약을 생성해야 합니다. 우리가 말했듯이 단백질이 없는 이 용액의 색은 갈색이어야 합니다..

연구원이 시약과 분광 광도계를 가지고 있으면 다음 단계를 따라야 합니다.

• 분광 광도계를 준비하고 올바른 작동을 확인합니다.
• 분석할 단백질 용액을 준비합니다. 이상적으로, 이 샘플은 총 용액 100마이크로리터당 5~100마이크로그램의 단백질을 포함해야 합니다. 정확한 농도는 알 수 없으나 최대값과 최소값임을 알 수 있습니다.
• 표준을 준비합니다. 우리는 그들이 수반하는 화학적 복잡성으로 인해 그들의 특성에 대해 다루지 않을 것입니다.
• 5ml의 시약을 용액에 넣고 5분간 배양합니다.
• 595 nm에서 분광 광도계에서 혼합물의 흡광도를 측정합니다.

결과는 분광 광도계 화면에 나타나며 조사를 수행하는 전문가가 기록해야 합니다. 일단 가지고 있으면, 축에서 두 가지 값, 즉 흡광도 대 단백질 마이크로그램을 마주하는 그래프(교정 곡선)를 생성해야 합니다.. 값으로 생성된 곡선에서 이를 외삽하여 용액의 정확한 단백질 농도를 얻을 수 있습니다.

이점

Bradford 방법은 실험실 분야와 관련된 누구나 수행하기 매우 쉽고, 모든 생물학자와 화학자는 수년 동안 적어도 한 번은 분광광도계를 접했기 때문에 시각. 잎을 으깨서 용액에 들어있는 엽록소의 양을 측정하거나(전형적인) 훨씬 더 복잡한 것들까지 분광 광도계는 다음 분야에서 매우 널리 퍼져 있습니다. 배우기.

그 용이성 뿐만 아니라, 자연 상태의 많은 단백질은 280 nm에서 매우 낮은 흡수 범위를 가지고 있습니다.. 모든 단백질이 이 값에 도달하는 것은 아닙니다. 이를 위해서는 항상 존재하지 않는 특정 아미노산(티로신, 페닐알라닌 및 트립토판)이 있어야 하기 때문입니다. 이 흡광도 수치는 UV 범위에 있기 때문에 거의 아무도 처리할 필요가 없는 특수 기계가 필요합니다.

정말, Bradford 방법에서 수행되는 것은 염료에 결합하여 단백질의 흡광도 값을 "증가"시키는 것입니다.. 이 상태에서 훨씬 더 쉽게 읽을 수 있을 뿐만 아니라 단백질은 샘플을 오염시킬 수 있는 다른 생물학적 분자의 흡광도 스펙트럼에서 멀어집니다.

이력서

이 소규모 화학 수업에서 우리는 관련 재료를 사용할 수 있는 경우 수행할 수 있는 가장 간단하고 쉬운 단백질 정량 방법 중 하나에 몰두했습니다. 어쨌든, 우리는 이 삶의 모든 것과 마찬가지로 완벽하지도 않고 오류도 없다는 점을 강조해야 합니다. 일반적으로 여러 분석을 위한 샘플의 희석액(0 µg/mL ~ 2000 µg/mL의 최소값 및 최대값), 이는 오류로 이어질 수 있습니다. 과정.

또한, 용액에 세제 및 기타 화합물이 있으면 방법의 올바른 개발을 방해할 수 있습니다. 다행히도 많은 경우 이러한 문제를 해결하기 위해 혼합물에 추가할 수 있는 다른 시약이 있습니다.

참고 문헌:

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