Bredforda metode: kas tas ir un kā tas darbojas

Olbaltumvielas ir makromolekulas, kas sastāv no aminoskābēm. Dabā ir aprakstītas aptuveni 500 dažādas aminoskābes, bet interesanti ir tas, ka tikai 20 ir būtiskākās cilvēka ķermenī. DNS satur visu nepieciešamo informāciju olbaltumvielu sintezēšanai kopš tā laika transkripcijas un tulkošanas mehānismi, DNS nukleotīdu triplets tiek pārveidots par aminoskābi betona.

Ribosomas ir organoīdi, kas ir atbildīgi par šo aminoskābju savienošanu, radot ķēdes ar mainīgu secību un garumu vai to pašu, ko mēs zinām kā olbaltumvielas. Šīs biomolekulas ir būtiskas, lai iedomātos dzīvi, jo tās veido aptuveni 80% sausās protoplazmas katrā šūnā un veido 50% no svara visos dzīvajos audos.

Ņemot vērā šos datus, mums ir vairāk nekā skaidrs olbaltumvielu nozīme dzīves veidošanā. Šodien mēs atvedīsim jums ļoti interesantu mehānismu, kas saistīts ar šo tēmu, jo mēs jums visu pastāstīsim Bredforda metode, kas paredzēts šķīduma olbaltumvielu koncentrācijas kvantitatīvai noteikšanai.

• Saistītais raksts: "Kāda ir zinātniskā metode un kā tā darbojas?"

Kāda ir Bredforda metode?

Bredforda metodi (angļu valodā pazīstamu kā Bradforda proteīnu eseju), kā norāda tās nosaukums, amerikāņu zinātniece Mariona Makkinlija Bredforda aprakstīja 1976. gadā. Pirmkārt, tas ir jāuzsver Tā ir spektrometriska metode - termins, kas ietver laboratorijas procedūru kopumu, kas balstīts uz elektromagnētiskā starojuma mijiedarbību ar analizējamo vielu (interesējošā sastāvdaļa, kuru vēlaties atdalīt no matricas).

Papildus tam jāatzīmē, ka tā ir kolorimetriska rakstura metode, tas ir, tas iegūst rezultātus, pamatojoties uz krāsām un to koncentrāciju konkrētā šķīdumā. Šī terminoloģiskā konglomerāta atslēga ir atrodama krāsā “Coomassie blue”, jo Bredforda metode kvantitatīvi nosaka tā absorbcijas izmaiņas atbilstoši noteiktiem parametriem. Šī krāsviela anjonā ir zila, neitrālā - zaļa un katjonu - sarkana.

Skābos apstākļos šķīdumā Koomassie zilā krāsa no sarkanās kļūst zilā krāsā un procesā saistās ar kvantitatīvi nosakāmajiem proteīniem. Ja ūdens vidē nav olbaltumvielu, maisījums paliek brūns, tāpēc ar šo metodiku vispirms ir ļoti viegli noteikt šo makromolekulu klātbūtni.

Bredfordas metodes ķīmiskās bāzes

Mēs ieejam nedaudz sarežģītākā reljefā, jo ir pienācis laiks aprakstīt, kas notiek starp šīm molekulām, pārsniedzot tiešas krāsas izmaiņas. Pievienojoties olbaltumvielai, Koomasī zils katjonā un dubultā protonētā formā (sarkanā krāsā) veido ļoti spēcīgu nekovalentu saiti ar minēto makromolekulu., izmantojot van der valsa spēkus un elektrostatisko mijiedarbību.

Šī ķīmiskā kompleksa veidošanās laikā krāsa piešķir jonizējamām olbaltumvielu daļām brīvais elektrons (atcerieties, ka katijons = pozitīvs lādiņš, zaudē elektronus), kas izraisa olbaltumvielu stāvokļa traucējumus normāli. Tas atklāj noteiktas vielas, kas var radīt iepriekš aprakstītās savienības, kurās mēs netaisāmies apstāties to ķīmiskās sarežģītības dēļ. Apkopojot, jums jāzina tikai sekojošais:

Sarkana krāsa (katjona / nesaistīta ar olbaltumvielām) ≠ Zilā krāsa (anjona / saistīta ar olbaltumvielām)

Pamatojoties uz šo pieņēmumu, jāatzīmē, ka sarkanās krāsas absorbcijas spektrs ir 465 nm, vērtība, kas atspoguļo krītošo elektromagnētisko starojumu, ko materiāls absorbē frekvenču diapazonā. Anjonu zilā formā (mijiedarbojoties ar olbaltumvielām) absorbcijas izmaiņas notiek pie 595 nm. Tāpēc šķīdumā, kas pakļauts Bredfordas metodei, rādījumus veic spektrofotometros 595 nm diapazonā.

Absorbcijas pieaugums šajā spektrā ir tieši proporcionāls saišu skaitam starp krāsvielu un olbaltumvielām, tāpēc tas nav Tiek konstatēts tikai tas, ka ir olbaltumvielas ar krāsas maiņu, bet ir iespējams arī novērtēt, cik daudz olbaltumvielu ir uz mililitru barotnes šķidrums. Neticami taisnība?

• Jūs varētu interesēt: "Laboratorijas materiāls: 23 svarīgi priekšmeti un instrumenti"

Bredforda metodes procedūra

Lai veiktu šo metodiku, ir nepieciešams spektrofotometrs, kas nav gluži lēts (aptuveni aptuveni 2000 eiro), tāpēc to nevar palaist no mājām. Šī iekārta spēj projicēt monohromatisku gaismas staru caur paraugu, lai izmērītu gaismas daudzumu, ko absorbē interesējošie savienojumi. Tādējādi pētnieks saņem informāciju par attiecīgajā šķīdumā esošo molekulu raksturu un, starp citu, spēj aprēķināt arī minētās molekulas koncentrāciju.

Turklāt jāatzīmē, ka reaģents nav tikai "neapstrādāts" Koomassie zils. 100 miligramus krāsvielas jāizšķīdina 50 mililitros 95% etanola šķīduma un pievieno 100 mililitrus 85% fosforskābes. Pēc tam, kad krāsa ir izšķīdusi, ir nepieciešams to atšķaidīt līdz litram un maisījumu filtrēt, lai iegūtu metodē izmantoto galīgo reaģentu. Kā jau teicām, šī šķīduma krāsai bez olbaltumvielām jābūt brūnganai.

Kad pētniekam ir reaģents un spektrofotometrs, viņam jāveic šādas darbības:

• Sagatavojiet spektrofotometru un pārbaudiet tā pareizu darbību.
• Sagatavo analizējamo olbaltumvielu šķīdumu. Ideālā gadījumā šajā paraugā vajadzētu būt no 5 līdz 100 mikrogramiem olbaltumvielu uz 100 mikrolitriem kopējā šķīduma. Ir skaidrs, ka precīza koncentrācija nav zināma, taču tās ir maksimālās un minimālās vērtības.
• Sagatavojiet standartus. Mēs neplānosim iedziļināties viņu īpatnībās to izraisīto ķīmisko komplikāciju dēļ.
• Šķīdumam pievieno 5 mililitrus reaģenta un ļauj tam inkubēties 5 minūtes.
• Mēra maisījuma absorbciju uz spektrofotometra pie 595 nm.

Rezultāti parādīsies spektrofotometra ekrānā, un tos vajadzētu atzīmēt profesionālim, kurš veic izmeklēšanu. Kad viņi to ir izdarījuši, ir jāizveido grafiks (kalibrēšanas līkne), uz kura asīm vērstas divas vērtības: absorbcija pret olbaltumvielu mikrogramiem. Pēc līknes, kas izveidota ar vērtībām, tās var ekstrapolēt, lai iegūtu precīzu olbaltumvielu koncentrāciju šķīdumā.

Priekšrocība

Bredforda metodi ir ļoti viegli veikt ikvienam, kas saistīts ar laboratorijas jomu, tā kā katrs biologs un ķīmiķis vismaz vienu studiju gadu ir saskāries ar spektrofotometru laiks. Vai nu, lai izmērītu hlorofila daudzumu šķīdumā no lapas sasmalcināšanas (tipisks) daudz sarežģītākām lietām spektrofotometri ir ļoti plaši izplatīti mācīšanās.

Papildus tā vieglumam, Jāatzīmē, ka daudziem proteīniem to dabiskajā stāvoklī ir ārkārtīgi mazs absorbcijas diapazons pie 280 nm. Pat visas olbaltumvielas nesasniedz šo vērtību, jo tāpēc tām jābūt specifiskām aminoskābēm (tirozīns, fenilalanīns un triptofāns), kuru ne vienmēr ir. Tā kā šis absorbcijas rādītājs ir UV diapazonā, ir nepieciešama īpaša mašīna, kas gandrīz nevienam nav jāapstrādā.

Tiešām, tas, kas tiek darīts ar Bredforda metodi, ir "palielināt" olbaltumvielu absorbcijas vērtību, saistoties ar krāsu. Papildus tam, ka šajā stāvoklī olbaltumvielas ir daudz vieglāk nolasāmas, tās attālinās no citu bioloģisko molekulu absorbcijas spektriem, kas varētu piesārņot paraugu.

Turpināt

Šajā mazajā ķīmijas klasē mēs esam iegremdējušies vienā no vienkāršākajām un vieglāk veicamajām olbaltumvielu kvantēšanas metodēm, ja ir pieejams attiecīgais materiāls. Jebkurā gadījumā mums jāuzsver, ka, tāpat kā viss šajā dzīvē, arī tas nav ideāls un nekļūdīgs: parasti ir nepieciešams izgatavot vairākus analizējamā parauga atšķaidījumi (minimālās un maksimālās vērtības no 0 µg / ml līdz 2000 µg / ml), kas var izraisīt kļūdas process.

Turklāt mazgāšanas līdzekļu un citu savienojumu klātbūtne šķīdumā var novērst pareizu metodes attīstību. Par laimi, ir daudz citu reaģentu, kurus var pievienot maisījumam, lai daudzos gadījumos atrisinātu šīs problēmas.

Bibliogrāfiskās atsauces:

• Compton, S. Dž., Džonss, C. G. (1985). Krāsu reakcijas un traucējumu mehānisms Bredforda olbaltumvielu testā. Analītiskā bioķīmija, 151 (2), 369-374.
• Ernsts, O., un Zors, T. (2010). Bredforda olbaltumvielu testa linearizācija. Vizualizēto eksperimentu žurnāls: JoVE, (38).
• Frīdenauers, S., un Berlets, H. H. (1989). Bredforda proteīna testa jutīgums un mainīgums mazgāšanas līdzekļu klātbūtnē. Analītiskā bioķīmija, 178 (2), 263-268.
• Viņš, F. (2011). Bredforda olbaltumvielu tests. Bioprotokols, e45-e45.
• Džonss, C. G., Zaķis, Dž. D., & Compton, S. Dž. (1989). Augu olbaltumvielu mērīšana ar Bredforda testu. Ķīmiskās ekoloģijas žurnāls, 15 (3), 979-992.
• Lopess, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Uzlabots Bradford olbaltumvielu tests kolagēna olbaltumvielām. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zors, T. un Selingers, Z. (1996). Bredforda olbaltumvielu testa linearizēšana palielina tā jutīgumu: teorētiskie un eksperimentālie pētījumi. Analītiskā bioķīmija, 236 (2), 302-308.