Recombinant DNA: definitie en proces

De techniek van Recombinant DNA (DNAr) is een techniek die wordt gebruikt voor genetische manipulatie en die bestaat uit het creëren van in vitro van kunstmatige DNA-moleculen waarin genetisch materiaal van verschillende soorten wordt gecombineerd. Om deze reden worden de aldus verkregen moleculen chimeer DNA of chimeren genoemd.

Deze techniek vormt de basis van biotechnologie en genetische manipulatie en kent meerdere toepassingen, variërend van landbouw tot biogeneeskunde. Het maakt bijvoorbeeld de studie van de expressie van een bepaald gen mogelijk, waardoor soorten worden verkregen planten die resistent zijn tegen bepaalde plagen of die humane insuline uit bronnen verkrijgen dieren.

In deze les van een LERAAR laten we je de definitie van recombinant DNA, waar het voor is en het proces dat wordt gehouden. We zullen alle stadia analyseren zodat u deze genetische techniek beter kent. We begonnen!

De recombinant-DNA-techniek bestaat uit: het introduceren van het geselecteerde gen in een vector.

Een vector is een kleine reeks van DNA die gemakkelijk te isoleren is, zoals a plasmide (Circulair en extrachromosomaal DNA dat typisch is voor bacteriën en andere prokaryotische organismen).

De vector die het gen van belang draagt, wordt in een gastheercel geïntroduceerd waar het in staat zal zijn om replicerenonafhankelijk van cellulair DNA.

Waar dient recombinant DNA voor?

Met behulp van de machinerie van de gastheercel zal het door de vector geïntroduceerde gen tot expressie worden gebracht, wat leidt tot de synthese van het eiwit dat door het gen wordt gecodeerd. Bovendien, wanneer de dragercel repliceert, zullen de resulterende cellen ook het gen bevatten, waardoor een nieuwe genetisch gemodificeerde cellijn.

De stadia van het verkrijgen van rDNA zijn als volgt:

1- Isolatie en zuivering van het gen van belang

In deze eerste stap is het doel om het te recombineren gen te isoleren (bijvoorbeeld het gen voor humane insuline of een groeifactor, enz.)

• Het verkrijgen van cellulair DNA: Hiervoor is het nodig dat het DNA het DNA uit de cellen losmaakt, dat door cellyse moet worden afgebroken. Wanneer cellen breken, geven ze hun genetisch materiaal (DNA) af samen met andere moleculen zoals eiwitten of RNA, daarom is het noodzakelijk om het cellulaire DNA te isoleren en te zuiveren.
• Het geïsoleerde gen verkrijgen: Zodra het cellulaire DNA is geparificeerd en geconcentreerd, is het noodzakelijk om het DNA te knippen met behulp van restrictie-enzymen (zeer specifieke enzymen die de DNA-sequentie op bepaalde punten kunnen doorbreken). De werking van geschikte restrictie-enzymen maakt het gen vrij dat door middel van centrifugatie- of chromatografietechnieken kan worden geïsoleerd.

2- Vorming van recombinant DNA

De vector is het genetische materiaal dat het geïsoleerde gen opnemen en transporteren and binnen in de gastheercel.
De vector is meestal een plasmide (circulair DNA typisch voor prokaryoten), een virus of een kunstmatig gecreëerd chromosoom, dat aan de volgende kenmerken moet voldoen:

• Het moet gemakkelijk te isoleren en klein van formaat zijn.
• Het moet sequenties bevatten die worden herkend door de factoren die het gewenste gen introduceren.
• Het moet in staat zijn om de gastheercel binnen te gaan om er onafhankelijk van het cellulaire DNA in te repliceren.
• Het moet een genetische marker bevatten waarmee het gemakkelijk kan worden geïdentificeerd en geïsoleerd, zoals een antibioticumresistentiegen.

De stadia Er zijn twee van deze tweede fase van het recombinant-DNA-proces:

1. Snijd de vector: Met dezelfde restrictie-enzymen die zijn gebruikt om het in te voegen gen te verkrijgen, wordt een snede gemaakt in het vector-DNA, waardoor twee uiteinden van het DNA vrij blijven.
2. Voer het gen in: De vrije uiteinden veroorzaakt door de werking van restrictie-enzymen zijn het punt waar het eerder geïsoleerde gen zal worden ingevoegd in de eerste fase van isolatie en zuivering van het gen. De vereniging tussen de vector en het gen (dat eenmaal in de vector is geïntroduceerd, een insertie wordt genoemd), vindt plaats door actie van het enzym ligase dat de covalente binding katalyseert tussen de vector en de insert die aanleiding geeft tot het molecuul van Recombinant DNA.

3- Introductie van rDNA in de gastheercel

Deze stap kan worden gedaan door: verschillende technieken zoals het door fysicochemische middelen veranderen van de permeabiliteit van het membraan van de gastheercel om de doorgang van rDNA mogelijk te maken, micro-injectie van rDNA Met behulp van een micropipet, de introductie van rDNA in liposomen die in staat zijn te fuseren met het celmembraan om de inhoud vrij te geven in het cytoplasma van de cel Gast.

De gastheercellen moeten cellen zijn die zich zeer snel voortplanten, met behulp van bacteriële cellen, gistcellen of kankercellen.

4- Cultuur van gastheercellen

Zodra het rDNA in de gastheercellen is geïntroduceerd, worden gecultiveerd door hun deling te induceren om een ​​groot aantal cellen te verkrijgen die het rDNA bevatten. De cellen worden gekweekt in petrischalen die de isolatie van kolonies mogelijk maken. die vervolgens in vloeibare media worden gekweekt, waardoor een groot aantal klonen wordt verkregen (genetisch identieke cellen ).

5- Detectie en selectie van cellen die recombinant DNA bevatten

In deze laatste fase gaat het om: cellen identificeren met rDNA. Om deze cellen te identificeren, worden markers gebruikt om de aanwezigheid van rDNA te detecteren. Deze Genetische markers kunnen divers zijn, een voorbeeld is de kweek van gastheercellen in aanwezigheid van a antibiotica. Wanneer het antibioticumresistentiegen dat in de kweek aanwezig is, eerder in het rDNA is opgenomen.