Metoda Bradford: ce este și cum funcționează

Proteinele sunt macromolecule formate din aminoacizi. În natură au fost descriși aproximativ 500 de aminoacizi diferiți, dar, curios, doar 20 sunt cei esențiali prezenți în corpul uman. ADN-ul conține toate informațiile necesare pentru ca o proteină să fie sintetizată, încă din mecanisme de transcriere și traducere, un triplet de nucleotidă ADN este transformat într-un aminoacid beton.

Ribozomii sunt organitele responsabile de asamblarea acestor aminoacizi, dând naștere la lanțuri cu ordine și lungime variabile, sau ceea ce este același, ceea ce noi cunoaștem ca proteine. Aceste biomolecule sunt esențiale pentru a concepe viața, deoarece reprezintă aproximativ 80% din protoplasma uscată din fiecare celulă și reprezintă 50% din greutatea tuturor țesuturilor vii.

Cu aceste date în mână, este mai mult decât clar pentru noi importanța proteinelor în generația vieții. Astăzi venim să vă aducem un mecanism foarte interesant legat de acest subiect, pentru că vă vom spune totul despre Metoda lui Bradford, conceput pentru a cuantifica concentrația de proteine a unei soluții.

instagram story viewer

Articol asociat: "Care este metoda științifică și cum funcționează?"

Care este metoda Bradford?

Metoda Bradford (cunoscută sub numele de eseul proteic Bradfords în limba engleză) a fost descrisă, după cum sugerează și numele său, de omul de știință american Marion Mckinley Bradford, în 1976. În primul rând, este necesar să subliniem că Este o metodă spectrometrică, un termen care cuprinde un set de proceduri de laborator bazate pe interacțiunea radiației electromagnetice cu un analit (componenta de interes pe care doriți să o separați de matrice).

În plus față de aceasta, trebuie remarcat faptul că este o metodă de natură colorimetrică, adică aceea obține rezultate pe baza culorilor și a concentrației acestora într-o soluție specifică. Cheia acestui conglomerat terminologic se găsește în colorantul „Coomassie blue”, deoarece metoda Bradford cuantifică modificările absorbanței sale în funcție de anumiți parametri. Acest colorant apare albastru în forma sa anionică, verde în forma sa neutră și roșu în forma sa cationică.

În condiții acide în soluție, albastrul Coomassie se transformă din roșu în albastru și, în acest proces, se leagă de proteinele care trebuie cuantificate. Dacă nu există proteine în mediul apos, amestecul rămâne maro, deci este foarte ușor să detectăm prezența acestor macromolecule în primă instanță cu această metodologie.

Bazele chimice ale metodei Bradford

Intrăm într-un teren puțin mai complex, deoarece este timpul să descriem ce se întâmplă între aceste molecule dincolo de schimbările directe de culoare. La îmbinarea cu proteina, albastrul Coomassie în forma sa cationică și dublă protonată (roșu) formează o legătură necovalentă foarte puternică cu respectiva macromoleculă., prin forțele van der waals și interacțiunile electrostatice.

În timpul formării acestui complex chimic, colorantul donează porțiunilor ionizabile ale proteinei sale electron liber (amintiți-vă că cation = sarcină pozitivă, pierde electroni), care provoacă perturbarea stării proteinei normal. Aceasta expune anumite substanțe care pot genera uniunile descrise anterior, în care nu vom opri din cauza complexității lor chimice. În rezumat, trebuie doar să știți următoarele:

Colorant roșu (cationic / nu legat de proteine) ≠ Colorant albastru (anionic / legat de proteine)

Pe baza acestei premise, trebuie remarcat faptul că vopseaua roșie are un spectru de absorbție de 465 nm, o valoare care reprezintă radiația electromagnetică incidentă pe care un material o absoarbe într-un interval de frecvențe. În forma albastră anionică (care interacționează cu proteinele), o modificare a absorbției are loc la 595 nm. Prin urmare, într-o soluție supusă metodei Bradford, citirile se fac în spectrofotometre la un interval de 595 nm.

Creșterea absorbției în acest spectru este direct proporțională cu numărul de legături dintre colorant și proteine, deci nu Se detectează doar că există proteine cu schimbarea culorii, dar este, de asemenea, posibilă estimarea cantității de proteine pe mililitru de mediu lichid. Incredibil adevărat?

S-ar putea să vă intereseze: „Material de laborator: 23 de obiecte și instrumente esențiale”

Procedura metodei Bradford

Pentru a putea realiza această metodologie, este necesar un spectrofotometru, care nu este tocmai ieftin (aproximativ 2.000 de euro), deci nu este ceva ce poate fi rulat de acasă. Această mașină este capabilă să proiecteze un fascicul de lumină monocromatic printr-o probă, pentru a măsura cantitatea de lumină care este absorbită de compușii de interes. Astfel, cercetătorul primește informații despre natura moleculelor din soluția în cauză și, de altfel, este, de asemenea, capabil să calculeze concentrația moleculei menționate.

Mai mult, trebuie remarcat faptul că reactivul nu este doar albastru Coomassie „brut”. 100 miligrame de colorant trebuie dizolvate în 50 mililitri de soluție de etanol 95% și 100 mililitri acid fosforic 85% adăugat. În plus, este necesar să se dilueze până la un litru odată ce vopseaua s-a dizolvat și să se filtreze amestecul, pentru a da naștere reactivului definitiv utilizat în metodă. Culoarea acestei soluții fără proteine prezente, așa cum am spus, ar trebui să fie maroniu.

Odată ce cercetătorul are reactivul și spectrofotometrul, el trebuie să urmeze pașii următori:

Pregătiți spectrofotometrul și verificați funcționarea corectă a acestuia.
Pregătiți soluția de proteină pentru a fi analizată. În mod ideal, această probă ar trebui să conțină între 5 și 100 micrograme de proteină la 100 microlitri de soluție totală. Este evident că nu se cunoaște concentrația exactă, dar acestea sunt valorile maxime și minime.
Pregătiți standarde. Nu vom intra în particularitățile lor din cauza complicațiilor chimice pe care le presupun.
Se adaugă 5 mililitri de reactiv la soluție și se lasă să se incubeze timp de 5 minute.
Măsurați absorbanța amestecului pe spectrofotometru la 595 nm.

Rezultatele vor apărea pe ecranul spectrofotometrului și ar trebui notate de profesionistul care efectuează investigația. Odată ce au făcut-o, este necesar să se creeze un grafic (curbă de calibrare) care să se confrunte cu două valori pe axele lor: absorbanță vs micrograme de proteine. Din curba generată cu valorile, acestea pot fi extrapolate pentru a obține concentrația exactă a proteinei în soluție.

Avantaj

Metoda Bradford este foarte ușor de realizat pentru oricine are legătură cu domeniul de laborator, întrucât fiecare biolog și chimist s-a confruntat cu un spectrofotometru în anii de studiu, cel puțin unul timp. Fie pentru a măsura cantitatea de clorofilă dintr-o soluție din zdrobirea unei frunze (tipic) la lucruri mult mai complexe, spectrofotometrele sunt foarte răspândite în domeniile învăţare.

Pe lângă ușurința sa, Trebuie remarcat faptul că multe proteine în starea lor naturală au un interval de absorbție extrem de scăzut, la 280 nm. Nici măcar toate proteinele nu ating această valoare, deoarece pentru aceasta trebuie să aibă aminoacizi specifici (tirozină, fenilalanină și triptofan), care nu sunt întotdeauna prezenți. Deoarece această cifră de absorbanță se află în gama UV, este necesară o mașină specială pe care aproape nimeni nu trebuie să le trateze.

Într-adevăr, ceea ce se face în metoda Bradford este de a „crește” valoarea absorbanței proteinelor prin legarea la un colorant. Pe lângă faptul că sunt mult mai ușor de citit în această stare, proteinele se îndepărtează de spectrele de absorbanță ale altor molecule biologice, care ar putea contamina proba.

Relua

În această mică clasă de chimie, ne-am scufundat într-una dintre cele mai simple și mai ușoare metode de cuantificare a proteinelor de realizat, cu condiția să fie disponibil materialul relevant. În orice caz, trebuie să subliniem că, la fel ca orice în această viață, nici nu este perfect și infailibil: este de obicei necesar să faci multiple diluții ale probei pentru analiză (valori minime și maxime de la 0 µg / mL la 2000 µg / mL), care pot duce la erori în timpul procesul.

Mai mult, prezența detergenților și a altor compuși în soluție poate împiedica dezvoltarea corectă a metodei. Din fericire, există și alți reactivi care pot fi adăugați la amestec pentru a rezolva aceste probleme în multe cazuri.

Referințe bibliografice:

Compton, S. J. și Jones, C. G. (1985). Mecanismul răspunsului și interferenței coloranților în testul proteinei Bradford. Biochimie analitică, 151 (2), 369-374.
Ernst, O. și Zor, T. (2010). Linealizarea testului de proteină Bradford. Jurnal de experimente vizualizate: JoVE, (38).
Friedenauer, S. și Berlet, H. H. (1989). Sensibilitatea și variabilitatea testului proteinei Bradford în prezența detergenților. Biochimie analitică, 178 (2), 263-268.
El, F. (2011). Testul proteinei Bradford. Bio-protocol, e45-e45.
Jones, C. G., Hare, J. D. și Compton, S. J. (1989). Măsurarea proteinelor vegetale cu testul Bradford. Jurnalul de ecologie chimică, 15 (3), 979-992.
López, J., Imperial, S., Valderrama, R., și Navarro, S. (1993). O analiză îmbunătățită a proteinelor Bradford pentru proteinele de colagen. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
Zor, T. și Selinger, Z. (1996). Linealizarea testului de proteină Bradford crește sensibilitatea acestuia: studii teoretice și experimentale. Biochimie analitică, 236 (2), 302-308.