Метод Брэдфорда: что это такое и как работает

Белки - это макромолекулы, состоящие из аминокислот. В природе описано около 500 различных аминокислот, но любопытно, что только 20 из них являются незаменимыми, присутствующими в организме человека. ДНК содержит всю информацию, необходимую для синтеза белка, поскольку через механизмы транскрипции и трансляции, триплет нуклеотидов ДНК превращается в аминокислоту конкретный.

Рибосомы - это органеллы, ответственные за сборку этих аминокислот, дающую начало цепям с порядком и переменной длиной, или, что то же самое, тем, что мы знаем как белки. Эти биомолекулы необходимы для зачатия жизни, поскольку на их долю приходится примерно 80% сухой протоплазмы в каждой клетке и 50% веса всех живых тканей.

Имея эти данные, мы более чем ясно понимаем важность белков в формировании жизни. Сегодня мы пришли, чтобы познакомить вас с очень интересным механизмом, связанным с этой темой, потому что мы расскажем вам все о Метод Брэдфорда, предназначенный для количественного определения концентрации белка в растворе.

• Связанная статья: «Что такое научный метод и как он работает?»

Что такое метод Брэдфорда?

Метод Брэдфорда (известный как эссе Брэдфорда на английском языке) был описан, как следует из его названия, американским ученым Марион Маккинли Брэдфорд в 1976 году. Прежде всего, необходимо подчеркнуть, что Это спектрометрический метод, термин, обозначающий набор лабораторных процедур, основанных на взаимодействии электромагнитного излучения с аналитом. (интересующий компонент, который вы хотите отделить от матрицы).

Помимо этого, следует отметить, что это метод колориметрического характера, то есть получает результаты на основе цветов и их концентрации в конкретном растворе. Ключ к этому терминологическому конгломерату находится в красителе «Кумасси синий», поскольку метод Брэдфорда количественно определяет изменения его поглощения в соответствии с определенными параметрами. Этот краситель имеет синий цвет в своей анионной форме, зеленый в своей нейтральной форме и красный в своей катионной форме.

В кислых условиях в растворе синий кумасси меняет цвет с красного на синий и при этом связывается с белками, подлежащими количественному определению. Если в водной среде нет белков, смесь остается коричневой, поэтому с помощью этой методики очень легко обнаружить присутствие этих макромолекул в первую очередь.

Химические основы метода Брэдфорда

Мы входим в немного более сложную местность, так как пришло время описать, что происходит между этими молекулами, помимо прямого изменения цвета. При соединении с белком кумасси синий в его катионной и двупротонированной форме (красный) образует очень прочную нековалентную связь с указанной макромолекулой., за счет сил Ван-дер-Ваальса и электростатических взаимодействий.

Во время образования этого химического комплекса краситель отдает ионизируемым частям белка свою свободный электрон (помните, что катион = положительный заряд, теряет электроны), что вызывает нарушение состояния белка обычный. Это обнажает определенные вещества, которые могут образовывать ранее описанные союзы, на которых мы не собираемся останавливаться из-за их химической сложности. Таким образом, вам нужно знать только следующее:

Красный краситель (катионный / не связанный с белком) ≠ Синий краситель (анионный / связанный с белком)

Исходя из этой предпосылки, следует отметить, что красный краситель имеет спектр поглощения 465 нм, значение, которое представляет падающее электромагнитное излучение, которое материал поглощает в диапазоне частот. В анионной синей форме (взаимодействующей с белками) изменение поглощения происходит при 595 нм. Следовательно, в растворе, подвергнутом методу Брэдфорда, показания снимаются на спектрофотометрах в диапазоне 595 нм.

Увеличение поглощения в этом спектре прямо пропорционально количеству связей между красителем и белками, поэтому оно не Обнаруживается только наличие белков с изменением цвета, но также можно оценить, сколько белка содержится на миллилитр среды. жидкость. Невероятная правда?

• Вам может быть интересно: «Лабораторный материал: 23 основных предмета и инструмента»

Процедура по методу Брэдфорда

Чтобы использовать эту методику, необходим спектрофотометр, который стоит недешево (примерно 2000 евро), поэтому им нельзя пользоваться из дома.. Эта машина способна проецировать монохроматический луч света через образец, чтобы измерить количество света, которое поглощается интересующими соединениями. Таким образом, исследователь получает информацию о природе молекул в рассматриваемом растворе и, кстати, также может рассчитать концентрацию указанной молекулы.

Кроме того, следует отметить, что реагент не просто «сырой» кумасси синий. 100 миллиграммов красителя следует растворить в 50 миллилитрах 95% раствора этанола и добавить 100 миллилитров 85% фосфорной кислоты. Кроме того, после растворения красителя необходимо разбавить его до литра и профильтровать смесь, чтобы получить окончательный реагент, используемый в методе. Цвет этого раствора без белков, как мы уже сказали, должен быть коричневатым..

Получив реагент и спектрофотометр, исследователь должен выполнить следующие шаги:

• Подготовьте спектрофотометр и проверьте его правильность работы.
• Приготовьте раствор белка для анализа. В идеале этот образец должен содержать от 5 до 100 микрограммов белка на 100 микролитров общего раствора. Очевидно, что точная концентрация неизвестна, но это максимальное и минимальное значения.
• Подготовьте стандарты. Мы не будем вдаваться в их подробности из-за химических осложнений, которые они влекут за собой.
• Добавьте к раствору 5 миллилитров реагента и дайте ему инкубироваться в течение 5 минут.
• Измерьте оптическую плотность смеси на спектрофотометре при 595 нм.

Результаты появятся на экране спектрофотометра и должны быть отмечены профессионалом, проводящим расследование. Как только они это сделают, необходимо построить график (калибровочную кривую), на осях которого будут стоять два значения: абсорбция против микрограммов белка.. Из кривой, построенной со значениями, их можно экстраполировать для получения точной концентрации белка в растворе.

Преимущество

Метод Брэдфорда очень легко применить для всех, кто имеет отношение к лабораторной сфере. поскольку каждый биолог и химик сталкивался со спектрофотометром за годы учебы, по крайней мере, один время. Либо для измерения количества хлорофилла в растворе от раздавливания листа (типично) для гораздо более сложных вещей, спектрофотометры очень широко распространены в областях обучение.

Помимо простоты, Следует отметить, что многие белки в их естественном состоянии имеют чрезвычайно низкий диапазон поглощения - 280 нм.. Даже не все белки достигают этого значения, потому что для этого они должны иметь определенные аминокислоты (тирозин, фенилаланин и триптофан), которые не всегда присутствуют. Поскольку этот показатель поглощения находится в УФ-диапазоне, для их обработки требуется специальный аппарат, которого почти ни у кого нет.

Действительно, то, что делается в методе Брэдфорда, - это «увеличивать» значение поглощения белков путем связывания с красителем.. Помимо того, что в этом состоянии их намного легче читать, белки уходят от спектров поглощения других биологических молекул, которые могут загрязнять образец.

Резюме

На этом небольшом уроке химии мы погрузились в один из самых простых и простых в использовании методов количественной оценки белка при условии наличия соответствующего материала. В любом случае, мы должны подчеркнуть, что, как и все в этой жизни, она тоже не идеальна и непогрешима: обычно необходимо делать несколько разведения пробы для анализа (минимальные и максимальные значения от 0 мкг / мл до 2000 мкг / мл), которые могут привести к ошибкам во время процесс.

Кроме того, присутствие в растворе детергентов и других соединений может помешать правильной разработке метода. К счастью, есть и другие реагенты, которые можно добавить в смесь для решения этих проблем во многих случаях.

Библиографические ссылки:

• Комптон, С. Дж., И Джонс, К. ГРАММ. (1985). Механизм реакции красителя и вмешательство в анализ белка Брэдфорда. Аналитическая биохимия, 151 (2), 369-374.
• Эрнст О. и Зор Т. (2010). Линеаризация анализа белка Брэдфорда. Журнал визуализированных экспериментов: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. ЧАС. (1989). Чувствительность и вариабельность анализа белка Брэдфорда в присутствии детергентов. Аналитическая биохимия, 178 (2), 263-268.
• Он, Ф. (2011). Анализ белка Брэдфорда. Биопротокол, e45-e45.
• Джонс, К. Г., Заяц, Дж. Д., & Комптон, С. Дж. (1989). Измерение растительного белка с помощью анализа Брэдфорда. Журнал химической экологии, 15 (3), 979-992.
• Лопес, Дж., Империал, С., Вальдеррама, Р., и Наварро, С. (1993). Улучшенный анализ протеина Брэдфорда для белков коллагена. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Зор Т. и Селинджер З. (1996). Линеаризация анализа белка Брэдфорда увеличивает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования. Аналитическая биохимия, 236 (2), 302-308.