Bradfordova metoda: kaj je in kako deluje

Beljakovine so makromolekule, sestavljene iz aminokislin. V naravi je bilo opisanih približno 500 različnih aminokislin, nenavadno pa je, da je le 20 bistvenih v človeškem telesu. DNK vsebuje vse informacije, potrebne za sintezo beljakovin, vse od mehanizmi transkripcije in translacije se trojček DNA nukleotidov pretvori v aminokislino beton.

Ribosomi so organele, odgovorne za sestavljanje teh aminokislin, ki povzročajo verige s spremenljivim vrstnim redom in dolžino ali kar je enako, kar poznamo kot beljakovine. Te biomolekule so bistvene za spočetje življenja, saj predstavljajo približno 80% suhe protoplazme v vsaki celici in predstavljajo 50% teže vseh živih tkiv.

S temi podatki nam je več kot jasno, kako pomembne so beljakovine pri ustvarjanju življenja. Danes vam želimo predstaviti zelo zanimiv mehanizem, povezan s to temo, saj vam bomo povedali vse o tem Bradfordova metoda, namenjen kvantificiranju koncentracije beljakovin v raztopini.

• Povezani članek: "Kaj je znanstvena metoda in kako deluje?"

Kaj je Bradfordova metoda?

Bradfordovo metodo (v angleščini znano kot Bradfordsov esej o beljakovinah) je leta 1976 opisala ameriška znanstvenica Marion Mckinley Bradford. Najprej je treba to poudariti Gre za spektrometrično metodo, izraz, ki zajema nabor laboratorijskih postopkov, ki temeljijo na interakciji elektromagnetnega sevanja z analitom. (komponenta, ki vas zanima, ki jo želite ločiti od matrike).

Poleg tega je treba opozoriti, da gre za kolorimetrično metodo, to je tisto pridobi rezultate na podlagi barv in njihove koncentracije v določeni raztopini. Ključ tega terminološkega konglomerata najdemo v barvi "Coomassie blue", saj Bradfordova metoda kvantificira spremembe v svoji absorpciji glede na določene parametre. To barvilo je videti modro v svoji anionski obliki, zeleno v nevtralni obliki in rdeče v svoji kationski obliki.

V kislih pogojih v raztopini se Coomassie modra spremeni iz rdeče v modro in se pri tem veže na beljakovine, ki jih je treba količinsko opredeliti. Če v vodnem mediju ni beljakovin, ostane zmes rjava, zato je s to metodologijo zelo enostavno najprej zaznati prisotnost teh makromolekul.

Kemijske osnove Bradfordove metode

Vstopili smo na malo bolj zapleten teren, saj je čas, da opišemo, kaj se dogaja med temi molekulami, poleg neposrednih barvnih sprememb. Ko se združi z beljakovino, Coomassie modra v svoji kationski in dvojno protonirani obliki (rdeča) tvori zelo močno nekovalentno vez z omenjeno makromolekulo., z van der waalsovimi silami in elektrostatičnimi interakcijami.

Med tvorbo tega kemičnega kompleksa barvilo daje ionizirajočim se delom beljakovin prosti elektron (ne pozabite, da je kation = pozitiven naboj, izgubi elektrone), kar povzroči motnje beljakovinskega stanja normalno. To izpostavlja nekatere snovi, ki lahko tvorijo prej opisane zveze, pri katerih se zaradi njihove kemijske kompleksnosti ne bomo ustavili. Če povzamemo, morate vedeti le naslednje:

Rdeče barvilo (kationno / ni vezano na beljakovine) ≠ modro barvilo (anionsko / vezano na beljakovine)

Na podlagi te predpostavke je treba opozoriti, da rdeče barvilo ima absorpcijski spekter 465 nm, vrednost, ki predstavlja vpadno elektromagnetno sevanje, ki ga material absorbira v območju frekvenc. V anionsko modri obliki (v interakciji z beljakovinami) pride do spremembe absorpcije pri 595 nm. Zato se v raztopini, ki je izpostavljena Bradfordovi metodi, odčitajo v spektrofotometrih v območju 595 nm.

Povečanje absorbance v tem spektru je sorazmerno s številom vezi med barvilom in beljakovinami, zato ni Ugotovljeno je le, da obstajajo beljakovine s spremembo barve, vendar je mogoče tudi oceniti, koliko beljakovin je na mililiter medija tekočina. Neverjetno res?

• Morda vas zanima: "Laboratorijsko gradivo: 23 bistvenih predmetov in instrumentov"

Postopek Bradfordove metode

Za izvajanje te metodologije je potreben spektrofotometer, ki ni ravno poceni (približno 2000 evrov), zato ni nekaj, kar bi lahko vodili od doma. Ta stroj lahko projicira monokromatski žarek svetlobe skozi vzorec, da izmeri količino svetlobe, ki jo absorbirajo zanimive spojine. Tako raziskovalec prejme informacije o naravi molekul v zadevni raztopini in je mimogrede tudi sposoben izračunati koncentracijo omenjene molekule.

Poleg tega je treba opozoriti, da reagent ni le "surov" Coomassie modri. 100 miligramov barvila je treba raztopiti v 50 mililitrih 95% raztopine etanola in dodati 100 mililitrov 85% fosforne kisline. Poleg tega ga je treba po raztapljanju barvila razredčiti na liter in zmes filtrirati, da nastane dokončni reagent, uporabljen v metodi. Kot smo že rekli, mora biti ta raztopina brez prisotnih beljakovin rjavkasta.

Ko ima raziskovalec reagent in spektrofotometer, mora slediti naslednjim korakom:

• Pripravite spektrofotometer in preverite njegovo pravilno delovanje.
• Pripravite raztopino beljakovin za analizo. V idealnem primeru bi moral ta vzorec vsebovati med 5 in 100 mikrogrami beljakovin na 100 mikrolitrov celotne raztopine. Očitno je, da natančne koncentracije niso znane, so pa največje in najmanjše vrednosti.
• Pripravite standarde. Zaradi njihovih kemičnih zapletov se ne bomo spuščali v njihove posebnosti.
• Raztopini dodajte 5 mililitrov reagenta in pustite, da se inkubira 5 minut.
• Izmerite absorbanco zmesi na spektrofotometru pri 595 nm.

Rezultati se bodo pojavili na zaslonu spektrofotometra in jih mora opozoriti strokovnjak, ki vodi preiskavo. Ko enkrat, ustvariti je treba graf (umeritveno krivuljo), ki se na svojih oseh sooča z dvema vrednostma: absorbance in mikrogramov beljakovin. Iz krivulje, ustvarjene z vrednostmi, jih lahko ekstrapoliramo, da dobimo natančno koncentracijo beljakovin v raztopini.

Prednost

Bradfordovo metodo je zelo enostavno izvesti za vse, ki so povezani z laboratorijskim področjem, saj se je vsak biolog in kemik v svojih študijskih letih soočil s spektrofotometrom vsaj z enim čas. Bodisi za merjenje količine klorofila v raztopini zaradi drobljenja lista (tipično) do mnogo bolj zapletenih stvari so spektrofotometri zelo razširjeni na področjih učenje.

Poleg svoje enostavnosti Treba je opozoriti, da imajo številne beljakovine v naravnem stanju izjemno nizko absorpcijsko območje, in sicer 280 nm. Te vrednosti ne dosežejo niti vsi proteini, ker morajo za to imeti posebne aminokisline (tirozin, fenilalanin in triptofan), ki niso vedno prisotne. Ker je ta vrednost absorpcije v območju UV, je za obdelavo potreben poseben stroj, ki ga skoraj nihče nima.

Res, pri Bradfordovi metodi se "poveča" absorpcijska vrednost beljakovin z vezavo na barvilo. Poleg tega, da so beljakovine v tem stanju veliko lažje, se odmikajo od spektrov absorpcije drugih bioloških molekul, ki bi lahko kontaminirale vzorec.

Nadaljuj

V tem majhnem tečaju kemije smo se potopili v eno najpreprostejših in najlažjih metod za določanje beljakovin, če je na voljo ustrezen material. V vsakem primeru pa moramo poudariti, da tako kot vse v tem življenju tudi ni popolno in nezmotljivo: običajno je treba narediti več razredčitve vzorca za analizo (najmanjše in največje vrednosti od 0 µg / ml do 2000 µg / ml), kar lahko privede do napak med Postopek.

Poleg tega lahko prisotnost detergentov in drugih spojin v raztopini prepreči pravilen razvoj metode. Na srečo obstajajo tudi drugi reagenti, ki jih lahko v mešanico dodamo za rešitev teh težav v mnogih primerih.

Bibliografske reference:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mehanizem odziva barvila in interference v Bradfordovem testu beljakovin. Analitična biokemija, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O. in Zor, T. (2010). Linearizacija Bradfordovega proteinskega testa. Časopis vizualiziranih poskusov: JoVE, (38).
• Friedenauer, S. in Berlet, H. H. (1989). Občutljivost in variabilnost Bradfordovega proteina v prisotnosti detergentov. Analitična biokemija, 178 (2), 263-268.
• On, F. (2011). Bradford test beljakovin. Bio-protokol, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Merjenje rastlinskih beljakovin z Bradfordovim testom. Časopis za kemijsko ekologijo, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R. in Navarro, S. (1993). Izboljšan Bradfordov test za beljakovine kolagena. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. in Selinger, Z. (1996). Linearizacija testa proteinov Bradford poveča njegovo občutljivost: teoretične in eksperimentalne študije. Analitična biokemija, 236 (2), 302-308.