วิธีแบรดฟอร์ด: มันคืออะไรและทำงานอย่างไร

โปรตีนเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน มีการอธิบายกรดอะมิโนที่แตกต่างกันประมาณ 500 ชนิดในธรรมชาติ แต่ที่น่าแปลกก็คือ มีเพียง 20 ชนิดเท่านั้นที่เป็นกรดอะมิโนที่จำเป็นในร่างกายมนุษย์ DNA มีข้อมูลทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนตั้งแต่จนถึง กลไกการถอดรหัสและการแปล DNA nucleotide triplet จะถูกแปลงเป็นกรดอะมิโน คอนกรีต.

ไรโบโซมเป็นออร์แกเนลล์ที่รับผิดชอบในการประกอบกรดอะมิโนเหล่านี้ ทำให้เกิดสายโซ่ที่มีลำดับและความยาวผันแปรได้ หรือสิ่งที่เหมือนกันคือสิ่งที่เรารู้ว่าเป็นโปรตีน ชีวโมเลกุลเหล่านี้มีความจำเป็นต่อการตั้งครรภ์ เนื่องจากพวกมันมีสัดส่วนประมาณ 80% ของโปรโตพลาสซึมแห้งในทุกเซลล์และคิดเป็น 50% ของน้ำหนักในเนื้อเยื่อที่มีชีวิตทั้งหมด

ด้วยข้อมูลเหล่านี้ ทำให้เราเข้าใจถึงความสำคัญของโปรตีนในการสร้างชีวิตได้ชัดเจนมากกว่า วันนี้เรามานำเสนอกลไกที่น่าสนใจมากเกี่ยวกับหัวข้อนี้เพราะเราจะบอกคุณทุกอย่างเกี่ยวกับ วิธีการของแบรดฟอร์ดออกแบบมาเพื่อหาปริมาณความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลาย

บทความที่เกี่ยวข้อง: "วิธีการทางวิทยาศาสตร์คืออะไรและทำงานอย่างไร"

วิธีแบรดฟอร์ดคืออะไร?

วิธีการของแบรดฟอร์ด (หรือที่เรียกว่าเรียงความโปรตีนของแบรดฟอร์ดในภาษาอังกฤษ) ได้รับการอธิบายโดยนักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน Marion Mckinley Bradford ตามชื่อของมันในปี 1976 ก่อนอื่นต้องเน้นว่า

instagram story viewer

เป็นวิธีการทางสเปกโตรเมทริก ซึ่งเป็นคำศัพท์ที่รวมชุดของขั้นตอนทางห้องปฏิบัติการโดยยึดตามปฏิสัมพันธ์ของรังสีแม่เหล็กไฟฟ้ากับสารวิเคราะห์ (องค์ประกอบที่น่าสนใจที่คุณต้องการแยกจากเมทริกซ์)

นอกจากนี้ควรสังเกตด้วยว่าเป็นวิธีการวัดสี กล่าวคือ ได้ผลลัพธ์ตามสีและความเข้มข้นของสีในสารละลายเฉพาะ. กุญแจสู่กลุ่มคำศัพท์นี้มีอยู่ในสีย้อม "คูแมสซีบลู" เนื่องจากวิธีแบรดฟอร์ดจะวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงตามพารามิเตอร์บางอย่าง สีย้อมนี้ปรากฏเป็นสีน้ำเงินในรูปประจุลบ สีเขียวในรูปที่เป็นกลาง และสีแดงในรูปประจุบวก

ภายใต้สภาวะที่เป็นกรดในสารละลาย Coomassie blue จะเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีน้ำเงิน และในกระบวนการนี้ จะจับกับโปรตีนเพื่อวัดปริมาณ หากไม่มีโปรตีนในตัวกลางที่เป็นน้ำ ส่วนผสมยังคงเป็นสีน้ำตาล ดังนั้นจึงเป็นเรื่องง่ายมากที่จะตรวจหาการมีอยู่ของโมเลกุลขนาดใหญ่เหล่านี้ในตัวอย่างแรกด้วยวิธีการนี้

ฐานเคมีของวิธีแบรดฟอร์ด

เรากำลังเข้าสู่ภูมิประเทศที่ซับซ้อนมากขึ้นเล็กน้อย เนื่องจากเป็นเวลาที่จะอธิบายว่าเกิดอะไรขึ้นระหว่างโมเลกุลเหล่านี้ นอกเหนือไปจากการเปลี่ยนสีโดยตรง เมื่อรวมกับโปรตีน Coomassie blue ในรูปแบบประจุบวกและโปรตอนคู่ (สีแดง) จะสร้างพันธะที่ไม่ใช่โควาเลนต์ที่แข็งแกร่งมากกับโมเลกุลดังกล่าวโดยแรงแวนเดอร์วาลส์และปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิต

ในระหว่างการก่อตัวของสารประกอบเชิงซ้อนทางเคมีนี้ สีย้อมจะบริจาคให้กับส่วนที่แตกตัวเป็นไอออนของโปรตีน อิเล็กตรอนอิสระ (จำไว้ว่า cation = ประจุบวก สูญเสียอิเล็กตรอน) ซึ่งทำให้เกิดการหยุดชะงักของสถานะโปรตีน ปกติ. สิ่งนี้ทำให้เห็นสารบางอย่างที่อาจก่อให้เกิดสหภาพที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งเราจะไม่หยุดทำงานเนื่องจากความซับซ้อนทางเคมีของพวกมัน โดยสรุป คุณจำเป็นต้องรู้สิ่งต่อไปนี้เท่านั้น:

สีย้อมสีแดง (ประจุบวก / ไม่ผูกมัดกับโปรตีน) ≠ สีย้อมสีน้ำเงิน (ประจุลบ / ผูกมัดกับโปรตีน)

จากสมมติฐานนี้ควรสังเกตว่า สีย้อมสีแดงมีสเปกตรัมการดูดกลืนแสง 465 นาโนเมตร ซึ่งเป็นค่าที่แสดงถึงการแผ่รังสีแม่เหล็กไฟฟ้าตกกระทบที่วัสดุดูดซับภายในช่วงความถี่. ในรูปประจุลบสีน้ำเงิน (โต้ตอบกับโปรตีน) การเปลี่ยนแปลงการดูดซึมจะเกิดขึ้นที่ 595 นาโนเมตร ดังนั้น ในสารละลายที่อยู่ภายใต้วิธีแบรดฟอร์ด การอ่านค่าในสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ช่วง 595 นาโนเมตร

การเพิ่มขึ้นของค่าการดูดกลืนแสงในสเปกตรัมนี้เป็นสัดส่วนโดยตรงกับจำนวนของพันธะระหว่างสีย้อมและโปรตีน ดังนั้นจึงไม่ ตรวจพบเพียงว่ามีโปรตีนที่มีการเปลี่ยนสี แต่ยังสามารถประมาณปริมาณโปรตีนที่มีต่อมิลลิลิตรของตัวกลางได้ ของเหลว เหลือเชื่อจริงหรือ?

คุณอาจสนใจ: "วัสดุในห้องปฏิบัติการ: 23 วัตถุและเครื่องมือที่จำเป็น"

ขั้นตอนวิธีแบรดฟอร์ด

เพื่อดำเนินการตามวิธีการนี้ จำเป็นต้องใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ ซึ่งไม่ถูกอย่างแน่นอน (ประมาณ 2,000 ยูโรโดยประมาณ) ดังนั้นจึงไม่ใช่สิ่งที่สามารถเรียกใช้จากที่บ้านได้. เครื่องนี้สามารถฉายลำแสงสีเดียวผ่านตัวอย่าง เพื่อวัดปริมาณแสงที่สารประกอบที่สนใจดูดกลืน ดังนั้น ผู้วิจัยจึงได้รับข้อมูลเกี่ยวกับธรรมชาติของโมเลกุลในสารละลายที่เป็นปัญหา และสามารถคำนวณความเข้มข้นของโมเลกุลดังกล่าวได้โดยบังเอิญ

นอกจากนี้ ควรสังเกตว่ารีเอเจนต์ไม่ได้เป็นเพียง "ดิบ" Coomassie blue ควรละลายสีย้อม 100 มิลลิกรัมในสารละลายเอทานอล 95% 50 มิลลิลิตรและเติมกรดฟอสฟอริก 85% 100 มิลลิลิตร นอกจากนี้ จำเป็นต้องเจือจางเป็นลิตรเมื่อสีย้อมละลายและกรองส่วนผสม เพื่อให้เกิดรีเอเจนต์ขั้นสุดท้ายที่ใช้ในวิธีการ สีของสารละลายนี้ไม่มีโปรตีนดังที่เราได้กล่าวไปแล้วควรเป็นสีน้ำตาล.

เมื่อผู้วิจัยมีรีเอเจนต์และสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แล้ว เขาต้องปฏิบัติตามขั้นตอนต่อไปนี้:

เตรียมสเปกโตรโฟโตมิเตอร์และตรวจสอบการทำงานที่ถูกต้อง
เตรียมสารละลายโปรตีนที่จะวิเคราะห์ ตามหลักการแล้ว ตัวอย่างนี้ควรมีโปรตีนระหว่าง 5 ถึง 100 ไมโครกรัมต่อสารละลายทั้งหมด 100 ไมโครลิตร เห็นได้ชัดว่าไม่ทราบความเข้มข้นที่แน่นอน แต่เป็นค่าสูงสุดและต่ำสุด
เตรียมมาตรฐาน. เราจะไม่พูดถึงลักษณะเฉพาะของพวกเขาเนื่องจากความซับซ้อนทางเคมีที่เกิดขึ้น
เพิ่มรีเอเจนต์ 5 มิลลิลิตรลงในสารละลายและปล่อยให้ฟักเป็นเวลา 5 นาที
วัดค่าการดูดกลืนแสงของส่วนผสมบนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 595 นาโนเมตร

ผลลัพธ์จะปรากฏบนหน้าจอของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ และควรสังเกตโดยผู้เชี่ยวชาญที่ดำเนินการตรวจสอบ เมื่อพวกเขามีแล้ว จำเป็นต้องสร้างกราฟ (เส้นโค้งการปรับเทียบมาตรฐาน) ที่เผชิญกับค่าสองค่าบนแกน: การดูดกลืนแสงเทียบกับไมโครกรัมของโปรตีน. จากกราฟที่สร้างด้วยค่าต่างๆ ค่าเหล่านี้สามารถคาดการณ์ได้เพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่แน่นอนของโปรตีนในสารละลาย

ความได้เปรียบ

วิธีของ Bradford นั้นง่ายมากสำหรับทุกคนที่เกี่ยวข้องกับสาขาห้องปฏิบัติการ เนื่องจากนักชีววิทยาและนักเคมีทุกคนต้องเผชิญกับสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในระหว่างที่เขาศึกษาอยู่อย่างน้อยหนึ่งราย เวลา. ไม่ว่าจะเป็นการวัดปริมาณคลอโรฟิลล์ในสารละลายจากการบดใบ (ทั่วไป) สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แพร่หลายอย่างมากในด้านของ การเรียนรู้

นอกจากความสะดวกแล้ว ควรสังเกตว่าโปรตีนหลายชนิดในสภาพธรรมชาติมีช่วงการดูดซึมต่ำมากที่ 280 นาโนเมตร. โปรตีนบางชนิดไม่ถึงค่านี้ด้วยซ้ำ เพราะสำหรับสิ่งนี้ พวกมันจะต้องมีกรดอะมิโนจำเพาะ (ไทโรซีน ฟีนิลอะลานีนและทริปโตเฟน) ซึ่งไม่ได้มีอยู่เสมอ เนื่องจากค่าการดูดกลืนแสงนี้อยู่ในช่วง UV จึงจำเป็นต้องใช้เครื่องจักรพิเศษที่แทบไม่มีใครต้องดูแลเลย

จริงๆ, สิ่งที่ทำในวิธีแบรดฟอร์ดคือการ "เพิ่ม" ค่าการดูดกลืนแสงของโปรตีนโดยการผูกมัดกับสีย้อม. นอกจากจะอ่านง่ายกว่ามากในสถานะนี้แล้ว โปรตีนยังเคลื่อนออกจากสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของโมเลกุลทางชีววิทยาอื่นๆ ซึ่งอาจปนเปื้อนตัวอย่างได้

เรซูเม่

ในชั้นเรียนเคมีขนาดเล็กนี้ เราได้นำวิธีการหาปริมาณโปรตีนที่ง่ายและสะดวกที่สุดวิธีหนึ่งไปใช้ โดยมีเนื้อหาที่เกี่ยวข้อง ไม่ว่าในกรณีใดเราต้องเน้นว่าเช่นเดียวกับทุกสิ่งในชีวิตนี้มันไม่สมบูรณ์แบบและไม่มีข้อผิดพลาด: มักจะจำเป็นต้องทำหลายรายการ การเจือจางตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์ (ค่าต่ำสุดและสูงสุด 0 µg / mL ถึง 2000 µg / mL) ซึ่งอาจนำไปสู่ข้อผิดพลาดระหว่าง กระบวนการ.

นอกจากนี้ การมีอยู่ของผงซักฟอกและสารประกอบอื่นๆ ในสารละลายสามารถป้องกันการพัฒนาวิธีการที่ถูกต้องได้ โชคดีที่มีรีเอเจนต์อื่นๆ ที่สามารถเพิ่มลงในส่วนผสมเพื่อแก้ปัญหาเหล่านี้ได้ในหลายกรณี

การอ้างอิงบรรณานุกรม:

คอมป์ตัน, เอส. เจ. & โจนส์ ซี. ก. (1985). กลไกการตอบสนองต่อสีย้อมและการแทรกแซงในการทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ด ชีวเคมีวิเคราะห์ 151 (2), 369-374
Ernst, O. และ Zor, T. (2010). การทำให้เป็นเส้นตรงของการทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ด วารสารการทดลองภาพ: JoVE, (38)
Friedenauer, S. และ Berlet, H. เอช (1989). ความไวและความแปรปรวนของการทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ดต่อหน้าผงซักฟอก ชีวเคมีวิเคราะห์ 178 (2) 263-268
เขา, เอฟ. (2011). การทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ด โปรโตคอลชีวภาพ e45-e45
โจนส์ ซี. G., Hare, J. ด. และคอมป์ตัน เอส. เจ (1989). การวัดโปรตีนจากพืชด้วยการทดสอบแบรดฟอร์ด วารสารนิเวศวิทยาเคมี, 15 (3), 979-992.
López, J., Imperial, S., Valderrama, R. และ Navarro, S. (1993). การทดสอบโปรตีน Bradford ที่ได้รับการปรับปรุงสำหรับโปรตีนคอลลาเจน Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
Zor, T. และ Selinger, Z. (1996). การทำให้เป็นเส้นตรงของการทดสอบโปรตีนในแบรดฟอร์ดช่วยเพิ่มความไว: การศึกษาเชิงทฤษฎีและการทดลอง ชีวเคมีวิเคราะห์, 236 (2), 302-308.