Bradford yöntemi: nedir ve nasıl çalışır?

Proteinler, amino asitlerden oluşan makromoleküllerdir. Doğada yaklaşık 500 farklı amino asit tanımlanmıştır, ancak ilginç bir şekilde, insan vücudunda bulunan temel amino asitlerden sadece 20 tanesidir. DNA, bir proteinin sentezlenmesi için gerekli tüm bilgileri içerir, çünkü transkripsiyon ve translasyon mekanizmaları, bir DNA nükleotid üçlüsü bir amino aside dönüştürülür Somut.

Ribozomlar, bu amino asitlerin bir araya getirilmesinden sorumlu organellerdir, sıralı ve değişken uzunlukta zincirler veya aynı şey, protein olarak bildiğimiz şey. Bu biyomoleküller, her hücredeki kuru protoplazmanın yaklaşık %80'ini oluşturdukları ve tüm canlı dokuların ağırlığının %50'sini oluşturdukları için, yaşamı kavramak için gereklidir.

Eldeki bu verilerle, proteinlerin yaşamın oluşmasındaki önemi bizim için çok açık. Bugün size bu konuyla ilgili çok ilginç bir mekanizma getirmeye geldik çünkü size bu konuyla ilgili her şeyi anlatacağız. Bradford'un yöntemi, bir çözeltinin protein konsantrasyonunu ölçmek için tasarlanmıştır.

• İlgili makale: "Bilimsel yöntem nedir ve nasıl çalışır?"

Bradford yöntemi nedir?

Bradford yöntemi (İngilizce Bradfords protein denemesi olarak bilinir), adından da anlaşılacağı gibi, 1976'da Amerikalı bilim adamı Marion Mckinley Bradford tarafından tanımlanmıştır. Öncelikle şunu vurgulamak gerekir. Elektromanyetik radyasyonun bir analit ile etkileşimine dayanan bir dizi laboratuvar prosedürünü kapsayan bir terim olan spektrometrik bir yöntemdir. (matriksten ayırmak istediğiniz ilgilenilen bileşen).

Buna ek olarak, kolorimetrik nitelikte bir yöntem olduğuna dikkat edilmelidir, yani renklere ve belirli bir çözeltideki konsantrasyonlarına dayalı sonuçlar elde eder. Bradford yöntemi absorbansındaki değişiklikleri belirli parametrelere göre ölçtüğünden, bu terminolojik konglomeranın anahtarı “Coomassie mavisi” boyasında bulunur. Bu boya, anyonik formunda mavi, nötr formunda yeşil ve katyonik formunda kırmızı görünür.

Çözeltideki asidik koşullar altında, Coomassie mavisi kırmızıdan maviye döner ve bu süreçte nicelendirilecek proteinlere bağlanır. Sulu ortamda protein yoksa karışım kahverengi kalır, bu nedenle bu metodoloji ile ilk aşamada bu makromoleküllerin varlığını tespit etmek çok kolaydır.

Bradford yönteminin kimyasal temelleri

Bu moleküller arasında doğrudan renk değişimlerinin ötesinde neler olduğunu açıklamanın zamanı geldiğinden, biraz daha karmaşık bir alana giriyoruz. Coomassie mavisi, proteinle birleştiğinde, katyonik ve çift protonlanmış formunda (kırmızı) söz konusu makromolekül ile çok güçlü kovalent olmayan bir bağ oluşturur., van der waals kuvvetleri ve elektrostatik etkileşimlerle.

Bu kimyasal kompleksin oluşumu sırasında boya, proteinin iyonlaşabilen kısımlarına protein durumunun bozulmasına neden olan serbest elektron (katyon = pozitif yük, elektron kaybeder) normal. Bu, kimyasal karmaşıklıkları nedeniyle durmayacağımız, daha önce açıklanan birleşmeleri oluşturabilecek belirli maddeleri açığa çıkarır. Özetle, yalnızca aşağıdakileri bilmeniz gerekir:

Kırmızı boya (katyonik / proteine ​​bağlı değil) ≠ Mavi boya (anyonik / proteine ​​bağlı)

Bu öncülden hareketle belirtmek gerekir ki, kırmızı boya, 465 nm'lik bir absorpsiyon spektrumuna sahiptir; bu, bir malzemenin bir frekans aralığında emdiği gelen elektromanyetik radyasyonu temsil eden bir değerdir.. Anyonik mavi formda (proteinlerle etkileşim halinde), 595 nm'de absorpsiyonda bir değişiklik meydana gelir. Bu nedenle Bradford yöntemine tabi tutulan bir çözeltide 595 nm aralığında spektrofotometrelerde okumalar yapılır.

Bu spektrumdaki absorbans artışı boya ve proteinler arasındaki bağ sayısı ile doğru orantılıdır. Sadece renk değiştiren proteinlerin olduğu tespit edilir, ancak besiyerinin mililitresinde ne kadar protein olduğunu da tahmin etmek mümkündür. sıvı. İnanılmaz doğru mu?

• İlginizi çekebilir: "Laboratuvar malzemesi: 23 temel nesne ve alet"

Bradford yöntemi prosedürü

Bu metodolojiyi gerçekleştirmek için, tam olarak ucuz olmayan (yaklaşık 2.000 Euro) bir spektrofotometre gereklidir, bu nedenle evden çalıştırılabilecek bir şey değildir.. Bu makine, ilgilenilen bileşikler tarafından emilen ışık miktarını ölçmek için bir numuneden monokromatik bir ışık huzmesi yansıtabilir. Böylece araştırmacı, söz konusu çözeltideki moleküllerin doğası hakkında bilgi alır ve tesadüfen söz konusu molekülün konsantrasyonunu da hesaplayabilir.

Ayrıca, reaktifin sadece "ham" Coomassie mavisi olmadığına dikkat edilmelidir. 100 miligram boya, 50 mililitre %95 etanol solüsyonunda çözülmeli ve 100 mililitre %85 fosforik asit eklenmelidir. Ek olarak, yöntemde kullanılan kesin reaktifi ortaya çıkarmak için, boya çözündükten sonra bir litreye seyreltilmesi ve karışımın filtre edilmesi gerekir. Protein içermeyen bu çözeltinin rengi, söylediğimiz gibi kahverengimsi olmalıdır..

Araştırmacı reaktifi ve spektrofotometreyi aldıktan sonra aşağıdaki adımları izlemelidir:

• Spektrofotometreyi hazırlayın ve doğru çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
• Analiz edilecek protein çözeltisini hazırlayın. İdeal olarak, bu numune, 100 mikrolitre toplam çözelti başına 5 ile 100 mikrogram arasında protein içermelidir. Kesin konsantrasyonun bilinmediği açıktır, ancak bunlar maksimum ve minimum değerlerdir.
• Standartları hazırlayın. İçerdikleri kimyasal komplikasyon nedeniyle özelliklerine girmeyeceğiz.
• Çözeltiye 5 mililitre reaktif ekleyin ve 5 dakika inkübasyona bırakın.
• Karışımın absorbansını 595 nm'de spektrofotometrede ölçün.

Sonuçlar spektrofotometrenin ekranında görünecek ve araştırmayı yürüten profesyonel tarafından not edilmelidir. Bir kez sahip olduklarında, eksenlerinde iki değer ile karşılaşan bir grafik (kalibrasyon eğrisi) oluşturmak gereklidir: absorbans vs mikrogram protein. Değerlerle oluşturulan eğriden, çözeltideki tam protein konsantrasyonunu elde etmek için bunlar tahmin edilebilir.

Avantaj

Bradford yöntemi, laboratuvar alanıyla ilgili herkes için uygulanması çok kolaydır, Her biyolog ve kimyager, yıllarca çalıştığı süre boyunca en az bir spektrofotometre ile karşılaştığından, zaman. Ya bir yaprağın ezilmesinden kaynaklanan bir çözeltideki klorofil miktarını ölçmek için (tipik) çok daha karmaşık şeylere, spektrofotometreler aşağıdaki alanlarda çok yaygındır. öğrenme.

Kolaylığının yanı sıra, Doğal hallerinde birçok proteinin 280 nm'de son derece düşük bir absorpsiyon aralığına sahip olduğu belirtilmelidir.. Tüm proteinler bile bu değere ulaşamaz, çünkü bunun için her zaman mevcut olmayan spesifik amino asitlere (tirozin, fenilalanin ve triptofan) sahip olmaları gerekir. Bu absorbans değeri UV aralığında olduğundan tedavi edilebilmesi için hemen hemen hiç kimsenin sahip olmadığı özel bir makineye ihtiyaç duyulmaktadır.

Gerçekten mi, Bradford yönteminde yapılan, bir boyaya bağlanarak proteinlerin absorbans değerini "artırmaktır".. Bu durumda okunması çok daha kolay olmasının yanı sıra, proteinler, numuneyi kontamine edebilecek diğer biyolojik moleküllerin absorbans spektrumlarından uzaklaşır.

Devam et

Bu küçük kimya dersinde, ilgili materyalin mevcut olması koşuluyla, gerçekleştirmesi en basit ve en kolay protein niceleme yöntemlerinden birine kendimizi kaptırdık. Her halükarda, bu hayattaki her şey gibi onun da mükemmel ve yanılmaz olmadığını vurgulamalıyız: genellikle birden çok şey yapmak gerekir. analiz için numunenin seyreltilmesi (minimum ve maksimum değerler 0 µg / mL ila 2000 µg / mL), sırasında hatalara yol açabilir. süreç.

Ayrıca çözeltide deterjan ve diğer bileşiklerin bulunması yöntemin doğru şekilde gelişmesini engelleyebilir. Neyse ki, çoğu durumda bu sorunları çözmek için karışıma eklenebilecek başka reaktifler de var.

Bibliyografik referanslar:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Bradford protein tahlilinde boya tepkisi ve girişim mekanizması. Analitik biyokimya, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O. ve Zor, T. (2010). Bradford protein tahlilinin doğrusallaştırılması. Görselleştirilmiş deneyler günlüğü: JoVE, (38).
• Friedenauer, S. ve Berlet, H. H. (1989). Deterjanların varlığında Bradford protein testinin duyarlılığı ve değişkenliği. Analitik biyokimya, 178 (2), 263-268.
• O, F. (2011). Bradford protein tahlili. Biyo-protokol, e45-e45.
• Jones, Ç. G., Tavşan, J. D., & Compton, S. J. (1989). Bradford tahlili ile bitki proteini ölçümü. Kimyasal ekoloji dergisi, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R. ve Navarro, S. (1993). Kollajen proteinleri için geliştirilmiş bir Bradford protein tahlili. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. ve Selinger, Z. (1996). Bradford protein testinin doğrusallaştırılması duyarlılığını artırır: teorik ve deneysel çalışmalar. Analitik biyokimya, 236 (2), 302-308.