Bradford-menetelmä: mikä se on ja miten se toimii

Proteiinit ovat makromolekyylejä, jotka koostuvat aminohapoista. Noin 500 erilaista aminohappoa on kuvattu luonnossa, mutta utelias vain 20 on välttämättömiä ihmiskehossa. DNA sisältää kaikki tarvittavat tiedot proteiinin syntetisoimiseksi siitä lähtien transkription ja translaation mekanismit, DNA-nukleotidien tripletti muutetaan aminohapoksi betoni.

Ribosomit ovat organelleja, jotka ovat vastuussa näiden aminohappojen kokoamisesta ja synnyttävät ketjuja, joiden pituudet vaihtelevat ja mitkä ovat samanlaisia, mitä tunnemme proteiineina. Nämä biomolekyylit ovat välttämättömiä elämän syntymiselle, koska niiden osuus jokaisessa solussa on noin 80% kuivasta protoplasmasta ja 50% kaikkien elävien kudosten painosta.

Kun nämä tiedot ovat kädessä, meille on enemmän kuin selvää proteiinien merkitys elämän luomisessa. Tänään tulemme tuomaan sinulle tähän aiheeseen liittyvän erittäin mielenkiintoisen mekanismin, koska kerromme sinulle kaiken Bradfordin menetelmä, joka on suunniteltu määrittelemään liuoksen proteiinipitoisuus.

• Aiheeseen liittyvä artikkeli: "Mikä on tieteellinen menetelmä ja miten se toimii?"

Mikä on Bradfordin menetelmä?

Amerikkalaisen tiedemiehen Marion Mckinley Bradfordin kuvaama Bradfordin menetelmä (englanniksi nimellä Bradfords-proteiini-essee englanniksi) on kuvattu, kuten nimestä voi päätellä. Ensinnäkin on tarpeen korostaa sitä Se on spektrometrinen menetelmä, termi, joka kattaa joukon laboratoriomenettelyjä, jotka perustuvat sähkömagneettisen säteilyn vuorovaikutukseen analyytin kanssa (kiinnostava komponentti, jonka haluat erottaa matriisista).

Tämän lisäksi on huomattava, että kyseessä on kolorimetrinen menetelmä, toisin sanoen saa tuloksia värien ja niiden pitoisuuden perusteella tietyssä ratkaisussa. Avain tähän terminologiseen ryhmittymään löytyy "Coomassie blue" -väriaineesta, koska Bradford-menetelmä kvantifioi muutokset absorbanssissaan tiettyjen parametrien mukaan. Tämä väriaine näyttää anionisessa muodossaan sinisenä, neutraalissa muodossaan vihreänä ja kationisessa muodossaan punaisena.

Happamissa olosuhteissa liuoksessa Coomassie-sininen muuttuu punaisesta siniseksi ja sitoutuu prosessissa kvantifioitaviin proteiineihin. Jos vesipitoisessa väliaineessa ei ole proteiineja, seos pysyy ruskeana, joten näiden menetelmien avulla on erittäin helppo havaita näiden makromolekyylien läsnäolo.

Bradford-menetelmän kemialliset emäkset

Olemme siirtymässä hieman monimutkaisempaan maastoon, koska on aika kuvata, mitä näiden molekyylien välillä tapahtuu suorien värimuutosten ulkopuolella. Liittymällä proteiiniin Coomassie-sininen muodostaa kationisessa ja kaksoisprotonoidussa muodossaan (punainen) erittäin vahvan ei-kovalenttisen sidoksen mainitun makromolekyylin kanssa., van der waalsin voimien ja sähköstaattisten vuorovaikutusten avulla.

Tämän kemiallisen kompleksin muodostumisen aikana väri luovuttaa sen proteiinin ionisoitaviin osiin vapaa elektroni (muista, että kationi = positiivinen varaus, menettää elektroneja), mikä aiheuttaa proteiinitilan häiriöitä normaalia. Tämä paljastaa tiettyjä aineita, jotka voivat synnyttää aiemmin kuvattuja yhdistyksiä, joita emme aio lopettaa niiden kemiallisen monimutkaisuuden vuoksi. Yhteenvetona, sinun on tiedettävä vain seuraavat:

Punainen väriaine (kationinen / ei sitoutunut proteiiniin) ≠ Sininen väriaine (anioninen / sitoutunut proteiiniin)

Tämän lähtökohdan perusteella on huomattava, että punaisen väriaineen absorptiospektri on 465 nm, arvo, joka edustaa tulevaa sähkömagneettista säteilyä, jonka materiaali absorboi taajuuksien alueella. Anionisessa sinisessä muodossa (vuorovaikutuksessa proteiinien kanssa) absorptio muuttuu 595 nm: ssä. Tästä syystä Bradford-menetelmälle altistetussa liuoksessa lukemat tehdään spektrofotometreillä 595 nm: n alueella.

Absorbanssin kasvu tässä spektrissä on suoraan verrannollinen värin ja proteiinien välisten sidosten määrään, joten se ei Havaitaan vain, että on proteiineja, joissa väri muuttuu, mutta on myös mahdollista arvioida, kuinka paljon proteiinia on millilitrassa väliainetta nestemäinen. Uskomaton totta?

• Saatat olla kiinnostunut: "Laboratoriomateriaali: 23 välttämätöntä esinettä ja instrumenttia"

Bradfordin menetelmän menettely

Tämän menetelmän toteuttamiseksi tarvitaan spektrofotometri, joka ei ole aivan halpa (noin 2000 euroa noin), joten sitä ei voi ajaa kotoa. Tämä kone pystyy heijastamaan näytteen läpi yksivärisen valonsäteen mittaamaan mielenkiinnon kohteena olevien yhdisteiden absorboiman valon määrän. Siksi tutkija saa tietoa kyseessä olevan liuoksen molekyylien luonteesta ja pystyy muuten myös laskemaan mainitun molekyylin pitoisuuden.

Lisäksi on huomattava, että reagenssi ei ole vain "raakaa" Coomassie-sinistä. 100 milligrammaa väriä tulisi liuottaa 50 millilitraan 95-prosenttista etanoliliuosta ja 100 millilitraan 85-prosenttista fosforihappoa. Lisäksi on välttämätöntä laimentaa se litraan, kun väriaine on liuennut, ja seos suodattaa, jotta saadaan menetelmässä käytetty lopullinen reagenssi. Kuten olemme sanoneet, tämän liuoksen värin ilman proteiineja tulisi olla ruskeaa.

Kun tutkijalla on reagenssi ja spektrofotometri, hänen on noudatettava seuraavia vaiheita:

• Valmista spektrofotometri ja tarkista sen oikea toiminta.
• Valmista analysoitava proteiiniliuos. Ihannetapauksessa tämän näytteen tulisi sisältää 5-100 mikrogrammaa proteiinia 100 mikrolitraa kohti kokonaisliuosta. On selvää, että tarkkaa pitoisuutta ei tiedetä, mutta ne ovat suurin ja pienin arvo.
• Valmista standardit. Emme aio mennä heidän erityispiirteisiinsä niiden aiheuttamien kemiallisten komplikaatioiden takia.
• Lisää liuokseen 5 ml reagenssia ja anna sen inkuboitua 5 minuuttia.
• Mitataan seoksen absorbanssi spektrofotometrillä aallonpituudella 595 nm.

Tulokset näkyvät spektrofotometrinäytössä, ja tutkimuksen suorittavan ammattilaisen tulee huomioida ne. Kun heillä on, on tarpeen luoda kaavio (kalibrointikäyrä), joka osoittaa akseleillaan kaksi arvoa: absorbanssi vs mikrogrammaa proteiinia. Näillä arvoilla muodostetusta käyrästä nämä voidaan ekstrapoloida, jotta saadaan tarkka proteiinipitoisuus liuoksessa.

Etu

Bradford-menetelmä on erittäin helppo suorittaa kaikille laboratorion kenttään liittyville, koska jokainen biologi ja kemisti on kohdannut ainakin yhden spektrofotometrin tutkimuksensa aikana aika. Joko klorofyllin määrän mittaamiseksi liuoksessa lehden murskaamisesta (tyypillinen) paljon monimutkaisemmista asioista spektrofotometrit ovat hyvin yleisiä oppiminen.

Sen helppouden lisäksi On huomattava, että monilla proteiineilla luonnollisessa tilassaan on erittäin matala absorptioalue 280 nm: ssä. Edes kaikki proteiinit eivät saavuta tätä arvoa, koska tätä varten niillä on oltava erityisiä aminohappoja (tyrosiini, fenyylialaniini ja tryptofaani), joita ei aina ole läsnä. Koska tämä absorbanssiluku on UV-alueella, tarvitaan erityinen kone, jota lähes kenelläkään ei ole, jotta niitä voidaan käsitellä.

Todella, mitä Bradford-menetelmällä tehdään, on "lisätä" proteiinien absorbanssiarvoa sitoutumalla väriaineeseen. Sen lisäksi, että proteiinit ovat paljon helpommin luettavissa tässä tilassa, ne siirtyvät pois muiden biologisten molekyylien absorbanssispektreistä, jotka voivat saastuttaa näytteen.

Jatkaa

Tässä pienessä kemian luokassa olemme uppoutuneet yksinkertaisimpaan ja helpoimmin suoritettavaan proteiinin kvantifiointimenetelmään edellyttäen, että asiaankuuluva materiaali on saatavilla. Joka tapauksessa meidän on korostettava, että kuten kaikki tässä elämässä, se ei ole myöskään täydellinen ja erehtymätön: yleensä on tarpeen tehdä useita analyysinäytteen laimennokset (pienin ja suurin arvo 0 µg / ml - 2000 µg / ml), mikä voi johtaa virheisiin prosessi.

Lisäksi pesuaineiden ja muiden yhdisteiden läsnäolo liuoksessa voi estää menetelmän oikean kehityksen. Onneksi seokseen voidaan lisätä muita reagensseja näiden ongelmien ratkaisemiseksi monissa tapauksissa.

Bibliografiset viitteet:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Värivasteen ja häiriöiden mekanismi Bradford-proteiinimäärityksessä. Analyyttinen biokemia, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Bradfordin proteiinimäärityksen linearisointi. Lehti visualisoiduista kokeista: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Bradford-proteiinimäärityksen herkkyys ja vaihtelu detergenttien läsnä ollessa. Analyyttinen biokemia, 178 (2), 263-268.
• Hän, F. (2011). Bradfordin proteiinimääritys. Bioprotokolla, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Kasviproteiinin mittaaminen Bradford-määrityksellä. Journal of Chemical Ecology, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Parannettu Bradford-proteiinimääritys kollageeniproteiineille. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. ja Selinger, Z. (1996). Bradfordin proteiinimäärityksen linearisointi lisää sen herkkyyttä: teoreettiset ja kokeelliset tutkimukset. Analyyttinen biokemia, 236 (2), 302-308.