Méthode Bradford: qu'est-ce que c'est et comment ça marche

Les protéines sont des macromolécules constituées d'acides aminés. Quelque 500 acides aminés différents ont été décrits dans la nature, mais curieusement, seuls 20 sont les essentiels présents dans le corps humain. L'ADN contient toutes les informations nécessaires à la synthèse d'une protéine, car grâce à mécanismes de transcription et de traduction, un triplet de nucléotides d'ADN est converti en un acide aminé béton.

Les ribosomes sont les organites responsables de l'assemblage de ces acides aminés, donnant lieu à des chaînes d'ordre et de longueur variables, ou ce qui est le même, ce que nous appelons des protéines. Ces biomolécules sont essentielles à la conception de la vie, car elles représentent environ 80 % du protoplasme sec dans chaque cellule et représentent 50 % du poids de tous les tissus vivants.

Avec ces données en main, il est plus que clair pour nous l'importance des protéines dans la génération de la vie. Aujourd'hui, nous venons vous apporter un mécanisme très intéressant lié à ce sujet, car nous vous dirons tout sur

La méthode de Bradford, conçu pour quantifier la concentration en protéines d'une solution.

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Qu'est-ce que la méthode Bradford ?

La méthode Bradford (connue sous le nom de Bradfords protein essai en anglais) a été décrite, comme son nom l'indique, par la scientifique américaine Marion Mckinley Bradford, en 1976. Tout d'abord, il faut souligner que C'est une méthode spectrométrique, un terme qui englobe un ensemble de procédures de laboratoire basées sur l'interaction d'un rayonnement électromagnétique avec un analyte (le composant d'intérêt que vous souhaitez séparer de la matrice).

En plus de cela, il convient de noter qu'il s'agit d'une méthode de nature colorimétrique, c'est-à-dire que obtient des résultats basés sur les couleurs et leur concentration dans une solution spécifique. La clé de ce conglomérat terminologique se trouve dans le colorant « bleu de Coomassie », puisque la méthode de Bradford quantifie les changements de son absorbance en fonction de certains paramètres. Ce colorant apparaît bleu sous sa forme anionique, vert sous sa forme neutre et rouge sous sa forme cationique.

Dans des conditions acides en solution, le bleu de Coomassie vire du rouge au bleu et, ce faisant, se lie aux protéines à quantifier. S'il n'y a pas de protéines dans le milieu aqueux, le mélange reste brun, il est donc très facile de détecter la présence de ces macromolécules dans un premier temps avec cette méthodologie.

Les bases chimiques de la méthode Bradford

Nous entrons dans un terrain un peu plus complexe, car il est temps de décrire ce qui se passe entre ces molécules au-delà des changements de couleur directs. En s'associant à la protéine, le bleu de Coomassie sous sa forme cationique et double protonée (rouge) forme une liaison non covalente très forte avec ladite macromolécule., par les forces de van der waals et les interactions électrostatiques.

Lors de la formation de ce complexe chimique, le colorant donne aux portions ionisables de la protéine son électron libre (rappelez-vous que cation = charge positive, perd des électrons), ce qui provoque une perturbation de l'état de la protéine Ordinaire. Cela expose certaines substances qui peuvent générer les unions décrites précédemment, dans lesquelles nous n'allons pas nous arrêter en raison de leur complexité chimique. En résumé, il vous suffit de connaître les éléments suivants :

Colorant rouge (cationique / non lié à la protéine) ≠ Colorant bleu (anionique / lié à la protéine)

Sur la base de cette prémisse, il convient de noter que le colorant rouge a un spectre d'absorption de 465 nm, valeur qui représente le rayonnement électromagnétique incident qu'un matériau absorbe dans une plage de fréquences. Dans la forme bleue anionique (interagissant avec les protéines), un changement d'absorption se produit à 595 nm. Par conséquent, dans une solution soumise à la méthode de Bradford, les lectures sont effectuées dans des spectrophotomètres à une plage de 595 nm.

L'augmentation de l'absorbance dans ce spectre est directement proportionnelle au nombre de liaisons entre le colorant et les protéines, elle ne Il est seulement détecté qu'il y a des protéines avec le changement de couleur, mais il est également possible d'estimer combien de protéines il y a par millilitre de milieu liquide. Incroyable vrai ?

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Procédure de la méthode Bradford

Pour mener à bien cette méthodologie, un spectrophotomètre est nécessaire, ce qui n'est pas vraiment bon marché (environ 2 000 euros environ), ce n'est donc pas quelque chose qui peut être exécuté depuis chez soi.. Cette machine est capable de projeter un faisceau de lumière monochromatique à travers un échantillon, afin de mesurer la quantité de lumière absorbée par les composés d'intérêt. Ainsi, le chercheur reçoit des informations sur la nature des molécules de la solution en question et, accessoirement, est également en mesure de calculer la concentration de ladite molécule.

Par ailleurs, il est à noter que le réactif n'est pas que du bleu de Coomassie « brut ». 100 milligrammes de colorant doivent être dissous dans 50 millilitres d'une solution d'éthanol à 95 % et 100 millilitres d'acide phosphorique à 85 % ajoutés. De plus, il est nécessaire de le diluer au litre une fois le colorant dissous et de filtrer le mélange, pour donner naissance au réactif définitif utilisé dans la méthode. La couleur de cette solution sans protéines présentes, comme nous l'avons dit, doit être brunâtre.

Une fois que le chercheur dispose du réactif et du spectrophotomètre, il doit suivre les étapes suivantes :

• Préparez le spectrophotomètre et vérifiez son bon fonctionnement.
• Préparer la solution de protéines à analyser. Idéalement, cet échantillon doit contenir entre 5 et 100 microgrammes de protéines pour 100 microlitres de solution totale. Il est évident que la concentration exacte n'est pas connue, mais ce sont les valeurs maximales et minimales.
• Préparer des normes. Nous n'entrerons pas dans leurs particularités en raison de la complication chimique qu'elles entraînent.
• Ajouter 5 millilitres de réactif à la solution et laisser incuber pendant 5 minutes.
• Mesurer l'absorbance du mélange sur le spectrophotomètre à 595 nm.

Les résultats apparaîtront sur l'écran du spectrophotomètre et devraient être notés par le professionnel qui mène l'enquête. Une fois qu'ils ont, il faut créer un graphique (courbe d'étalonnage) qui fait face à deux valeurs sur leurs axes: absorbance vs microgrammes de protéine. A partir de la courbe générée avec les valeurs, celles-ci peuvent être extrapolées pour obtenir la concentration exacte de protéines dans la solution.

avantage

La méthode Bradford est très facile à réaliser pour toute personne liée au domaine du laboratoire, puisque chaque biologiste et chimiste a affronté un spectrophotomètre au cours de ses années d'études au moins un fois. Soit pour mesurer la quantité de chlorophylle dans une solution issue du broyage d'une feuille (typique) à des choses beaucoup plus complexes, les spectrophotomètres sont très répandus dans les domaines de apprentissage.

En plus de sa facilité, Il est à noter que de nombreuses protéines à l'état naturel ont une plage d'absorption extrêmement faible, à 280 nm. Même toutes les protéines n'atteignent pas cette valeur, car pour cela elles doivent avoir des acides aminés spécifiques (tyrosine, phénylalanine et tryptophane), qui ne sont pas toujours présents. Comme ce chiffre d'absorbance est dans la gamme UV, une machine spéciale que presque personne n'a pour les traiter est nécessaire.

Réellement, ce qui est fait dans la méthode de Bradford est "d'augmenter" la valeur d'absorbance des protéines en se liant à un colorant. En plus d'être beaucoup plus faciles à lire dans cet état, les protéines s'éloignent des spectres d'absorbance des autres molécules biologiques, ce qui pourrait contaminer l'échantillon.

résumé

Dans ce petit cours de chimie, nous nous sommes immergés dans l'une des méthodes de quantification des protéines les plus simples et les plus faciles à réaliser, à condition que le matériel pertinent soit disponible. En tout cas, il faut souligner que, comme tout dans cette vie, il n'est pas non plus parfait et infaillible: il faut généralement faire plusieurs dilutions de l'échantillon à analyser (valeurs minimales et maximales de 0 µg/mL à 2000 µg/mL), pouvant conduire à des erreurs lors le processus.

De plus, la présence de détergents et d'autres composés dans la solution peut empêcher le développement correct de la méthode. Heureusement, il existe d'autres réactifs qui peuvent être ajoutés au mélange pour résoudre ces problèmes dans de nombreux cas.

Références bibliographiques:

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