Bradford módszer: mi ez és hogyan működik

A fehérjék aminosavakból álló makromolekulák. Körülbelül 500 különféle aminosavat írtak le a természetben, de érdekes módon csak 20 létfontosságú az emberi testben. A DNS minden információt tartalmaz, ami szükséges egy fehérje szintetizálásához, mivel a transzkripció és a transzláció mechanizmusai, a DNS nukleotidok triplettje átalakul aminosavvá Konkrét.

A riboszómák azok az organellumok, amelyek felelősek ezeknek az aminosavaknak az összeállításáért, változó rendű és hosszúságú láncok létrehozásáért, vagy ami ugyanaz, amit fehérjékként ismerünk. Ezek a biomolekulák elengedhetetlenek az élet fogantatásához, mivel minden sejtben a száraz protoplazma körülbelül 80% -át teszik ki, és az összes élő szövet tömegének 50% -át teszik ki.

Ezen adatok birtokában több mint világos számunkra a fehérjék jelentősége az élet létrehozásában. Ma eljutottunk egy nagyon érdekes mechanizmushoz, amely ehhez a témához kapcsolódik, mert mindent elmondunk Bradford módszere, amelynek célja az oldat fehérjekoncentrációjának számszerűsítése.

• Kapcsolódó cikk: "Mi a tudományos módszer és hogyan működik?"

Mi a Bradford módszer?

A Bradford-módszert (angolul Bradfords protein esszé néven ismert), amint a neve is mutatja, Marion Mckinley Bradford amerikai tudós írta le 1976-ban. Mindenekelőtt ezt kell hangsúlyozni Ez egy spektrometrikus módszer, olyan kifejezés, amely magában foglalja az elektromágneses sugárzás és az analit kölcsönhatásán alapuló laboratóriumi eljárások halmazát. (az érdekelt komponens, amelyet el akarsz választani a mátrixtól).

Ezen felül meg kell jegyezni, hogy ez egy kolorimetrikus jellegű módszer, vagyis az eredményeket kap a színek és azok koncentrációja alapján egy adott oldatban. Ennek a terminológiai konglomerátumnak a kulcsa a „Coomassie kék” festékben található, mivel a Bradford-módszer bizonyos paraméterek szerint számszerűsíti az abszorbancia változását. Ez a festék anionos formájában kéknek, semleges formájában zöldnek és kationos formájában vörösnek tűnik.

Az oldat savas körülményei között a Coomassie kék vörösről kékre változik, és ennek során a kvantálandó fehérjékhez kötődik. Ha a vizes közegben nincsenek fehérjék, akkor a keverék barna marad, ezért nagyon egyszerű kimutatni ezen makromolekulák jelenlétét ezzel a módszerrel.

A Bradford-módszer kémiai alapjai

Kicsit bonyolultabb terepre lépünk, mivel itt az ideje leírni, mi történik a molekulák között a közvetlen színváltozáson túl. A fehérjéhez kapcsolódva a Coomassie kék kationos és kettős protonált formában (piros) nagyon erős, nem kovalens kötést képez az említett makromolekulával., van der waals-erők és elektrosztatikus kölcsönhatások által.

Ennek a kémiai komplexnek a képződése során a festék a fehérje ionizálható részeire adományoz szabad elektron (ne feledje, hogy a kation = pozitív töltés, elveszíti az elektronokat), ami a fehérje állapotának megzavarását okozza Normál. Ez kitesz bizonyos anyagokat, amelyek előidézhetik a korábban leírt szakszervezeteket, amelyekben kémiai összetettségük miatt nem állunk meg. Összefoglalva, csak a következőket kell tudnia:

Vörös festék (kationos / nem kötődik fehérjéhez) ≠ Kék színezék (anionos / fehérjéhez kötött)

Ezen előfeltevés alapján meg kell jegyezni, hogy a vörös festék abszorpciós spektruma 465 nm, amely érték azt a beeső elektromágneses sugárzást képviseli, amelyet egy anyag egy frekvenciatartományban elnyel. Anionos kék formában (kölcsönhatásba lépve a fehérjékkel) az abszorpció változása 595 nm-en történik. Ezért egy Bradford-módszerrel kezelt oldatban 595 nm-es spektrofotométerekben leolvasást végzünk.

Az abszorbancia növekedése ebben a spektrumban egyenesen arányos a festék és a fehérjék közötti kötések számával, tehát nem Csak azt észlelik, hogy vannak fehérjék színváltozással, de meg lehet becsülni azt is, hogy mennyi fehérje van milliliter tápközegben folyékony. Hihetetlen igaz?

• Érdekelheti: "Laboratóriumi anyag: 23 alapvető tárgy és eszköz"

Bradford módszeres eljárás

Ennek a módszertannak a végrehajtásához spektrofotométerre van szükség, amely nem éppen olcsó (kb. 2000 euró), tehát nem futtatható otthonról. Ez a gép képes monokromatikus fénysugár kivetítésére egy mintán keresztül, hogy megmérje a kívánt vegyületek által elnyelt fénymennyiséget. Így a kutató információt kap a kérdéses oldatban lévő molekulák természetéről, és egyébként képes kiszámolni az említett molekula koncentrációját is.

Ezenkívül meg kell jegyezni, hogy a reagens nemcsak "nyers" Coomassie kék. 100 milligramm festéket fel kell oldani 50 ml 95% -os etanolos oldatban, és 100 ml 85% -os foszforsavat kell hozzáadni. Ezenkívül szükséges, hogy a festék feloldódása után literre hígítsák, és az elegyet szűrjék, hogy az eljárásban használt végleges reagens keletkezzen. Ennek az oldatnak a fehérje nélküli színe - amint mondtuk - barnásnak kell lennie.

Amint a kutató rendelkezik a reagenssel és a spektrofotométerrel, a következő lépéseket kell tennie:

• Készítse elő a spektrofotométert és ellenőrizze annak megfelelő működését.
• Készítse elő az elemzendő fehérjeoldatot. Ideális esetben ennek a mintának 5–100 mikrogramm fehérjét kell tartalmaznia 100 mikroliter teljes oldatban. Nyilvánvaló, hogy a pontos koncentráció nem ismert, de ezek a maximális és a minimális értékek.
• Készítse elő a szabványokat. Nem fogunk kitérni sajátosságaikra a kémiai komplikációk miatt.
• Adjon az oldathoz 5 ml reagenst, és hagyja 5 percig inkubálódni.
• Mérjük meg a keverék abszorbanciáját spektrofotométeren 595 nm-en.

Az eredmények megjelennek a spektrofotométer képernyőn, és a vizsgálatot végző szakembernek meg kell jegyeznie. Ha megvan, létre kell hozni egy grafikont (kalibrációs görbét), amely tengelyük két értékével áll szemben: abszorbancia vs mikrogramm fehérje. Az értékekkel generált görbéből ezeket extrapolálhatjuk, hogy megkapjuk a fehérje pontos koncentrációját az oldatban.

Előny

A Bradford-módszert nagyon könnyű elvégezni bárki számára, aki a laboratóriumi területtel kapcsolatos, mivel minden biológus és vegyész legalább egy tanulmányi éve alatt szembesült spektrofotométerrel idő. Vagy a klorofill mennyiségének mérése az oldatban egy levél aprításakor (tipikus) sokkal összetettebb dolgokra a spektrofotométerek nagyon elterjedtek a tanulás.

A könnyűség mellett Meg kell jegyezni, hogy sok fehérje természetes állapotában rendkívül alacsony abszorpciós tartományú, 280 nm-en. Még az összes fehérje sem éri el ezt az értéket, mert ehhez specifikus aminosavakkal kell rendelkezniük (tirozin, fenilalanin és triptofán), amelyek nem mindig vannak jelen. Mivel ez az abszorbancia érték az UV tartományban van, egy speciális gépre, amely szinte senkinek sincs, szükség van a kezelésükhöz.

Igazán, a Bradford-módszer szerint a fehérjék abszorbanciaértékét egy festékhez kötődve "növelik". Amellett, hogy ebben az állapotban sokkal könnyebben olvashatóak, a fehérjék eltávolodnak más biológiai molekulák abszorpciós spektrumaitól, amelyek szennyezhetik a mintát.

Önéletrajz

Ebben a kis kémia órán belemerültünk az egyik legegyszerűbben és legkönnyebben elvégezhető fehérje mennyiségi meghatározási módszerbe, feltéve, hogy a megfelelő anyag rendelkezésre áll. Mindenesetre hangsúlyoznunk kell, hogy mint minden ebben az életben, ez sem tökéletes és tévedhetetlen: általában többször kell elkészíteni az elemzéshez használt minta hígításai (0 és 2000 µg / ml közötti minimális és maximális érték), ami hibákhoz vezethet a folyamat.

Továbbá a detergensek és más vegyületek jelenléte az oldatban megakadályozhatja a módszer helyes kidolgozását. Szerencsére sok más reagens is hozzáadható a keverékhez, hogy ezeket a problémákat sok esetben megoldják.

Bibliográfiai hivatkozások:

• Compton, S. J. és Jones, C. G. (1985). A festékválasz és az interferencia mechanizmusa a Bradford protein assay-ben. Analitikai biokémia, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). A Bradford protein assay linearizálása. Vizualizált kísérletek folyóirata: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., és Berlet, H. H. (1989). A Bradford protein assay érzékenysége és változékonysága detergensek jelenlétében. Analitikai biokémia, 178 (2), 263-268.
• Ő, F. (2011). Bradford fehérje teszt. Bioprotokoll, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Növényi fehérje mérése Bradford assay-vel. Journal of Chemical Ecology, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). A kollagénfehérjék javított Bradford fehérje-vizsgálata. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., és Selinger, Z. (1996). A Bradford protein assay linearizálása növeli annak érzékenységét: elméleti és kísérleti vizsgálatok. Analitikai biokémia, 236 (2), 302-308.