Брадфордова метода: шта је то и како делује

Протеини су макромолекуле састављене од аминокиселина. У природи је описано око 500 различитих аминокиселина, али необично је да је само 20 основних неопходних у људском телу. ДНК садржи све информације потребне за синтезу протеина, од преко механизама транскрипције и транслације, триплет ДНК нуклеотида се претвара у аминокиселину бетон.

Рибосоми су органели одговорни за састављање ових аминокиселина, стварајући ланце са променљивим редоследом и дужином, или оно што је исто, оно што ми знамо као протеини. Ове биомолекуле су од суштинске важности за зачеће живота, јер чине око 80% суве протоплазме у свакој ћелији и представљају 50% тежине у свим живим ткивима.

Имајући ове податке на располагању, више нам је него јасан значај протеина у стварању живота. Данас долазимо да вам представимо врло занимљив механизам везан за ову тему, јер ћемо вам рећи све о томе Брадфордова метода, дизајниран да квантификује концентрацију протеина у раствору.

• Повезани чланак: „Шта је научна метода и како делује?“

Шта је Брадфордова метода?

Брадфордову методу (на енглеском познату као Брадфордсов есеј о протеинима) америчка научница Марион Мцкинлеи Брадфорд описала је 1976. године. Пре свега, потребно је то нагласити То је спектрометријска метода, појам који обухвата скуп лабораторијских поступака заснованих на интеракцији електромагнетног зрачења са аналитом (компонента од интереса коју желите да одвојите од матрице).

Уз ово треба напоменути да је то метода колориметријске природе, односно она добија резултате на основу боја и њихове концентрације у одређеном раствору. Кључ овог терминолошког конгломерата налази се у боји „Цоомассие блуе“, пошто Брадфорд метода квантификује промене у својој апсорбанцији према одређеним параметрима. Ова боја изгледа плаво у свом ањонском облику, зелена у свом неутралном облику и црвена у свом катионном облику.

Под киселим условима у раствору, Цоомассие плава боја прелази из црвене у плаву и при томе се везује за протеине који се квантификују. Ако у воденом медијуму нема протеина, смеша остаје смеђа, па је помоћу ове методологије врло лако прво открити присуство ових макромолекула.

Хемијске основе Брадфордове методе

Улазимо на мало сложенији терен, јер је време да опишемо шта се дешава између ових молекула мимо директних промена боје. Када се спаја са протеином, Цоомассие блуе у свом катионском и двоструко протонираном облику (црвени) формира врло јаку нековалентну везу са поменутом макромолекулом., ван дер ваалсовим силама и електростатичким интеракцијама.

Током формирања овог хемијског комплекса, боја даје јонизујуће делове протеина слободни електрон (сетите се да је катион = позитивно наелектрисање, губи електроне), што узрокује поремећај протеинског стања нормално. Ово излаже одређене супстанце које могу створити претходно описане уније, у којима се нећемо зауставити због њихове хемијске сложености. Укратко, морате знати само следеће:

Црвена боја (катионна / није везана за протеин) = Плава боја (ањонска / везана за протеин)

На основу ове премисе треба напоменути да црвена боја има спектар апсорпције од 465 нм, вредност која представља упадно електромагнетно зрачење које материјал апсорбује у опсегу фреквенција. У анионском плавом облику (у интеракцији са протеинима) долази до промене апсорпције на 595 нм. Због тога се у раствору подвргнутом Брадфордовој методи очитавају у спектрофотометрима у опсегу од 595 нм.

Повећање апсорбанције у овом спектру је директно пропорционално броју веза између боје и протеина, тако да није Откривено је само да постоје протеини са променом боје, али такође је могуће проценити колико протеина има по милилитру медијума течност. Невероватно тачно?

• Можда ће вас занимати: „Лабораторијски материјал: 23 основна предмета и инструменти“

Поступак Брадфордове методе

Да би се спровела ова методологија, неопходан је спектрофотометар, који није баш јефтин (отприлике 2.000 евра), па није нешто што се може покренути од куће. Ова машина је способна да пројектује монохроматски сноп светлости кроз узорак, како би измерила количину светлости коју апсорбују једињења од интереса. Дакле, истраживач добија информације о природи молекула у дотичном раствору и, случајно, такође може да израчуна концентрацију поменутог молекула.

Даље, треба напоменути да реагенс није само „сирова“ Цоомассие плава боја. 100 милиграма боје треба растворити у 50 милилитара 95% раствора етанола и додати 100 милилитара 85% фосфорне киселине. Поред тога, потребно је разблажити до литра након што се боја растопи и смеша филтрирати, да би се добио коначни реагенс који се користи у методи. Боја овог раствора без присутних протеина, као што смо рекли, треба да буде смећкаста.

Када истраживач добије реагенс и спектрофотометар, мора следити следеће кораке:

• Припремите спектрофотометар и проверите његов исправан рад.
• Припремите раствор протеина за анализу. Идеално би било да овај узорак садржи између 5 и 100 микрограма протеина на 100 микролитара укупног раствора. Очигледно је да тачна концентрација није позната, али су то максималне и минималне вредности.
• Припремите стандарде. Нећемо улазити у њихове посебности због хемијских компликација које они носе.
• У раствор додајте 5 милилитара реагенса и оставите да се инкубира 5 минута.
• Измерити апсорбанцију смеше на спектрофотометру на 595 нм.

Резултати ће се појавити на екрану спектрофотометра, а требало би да их забележи стручњак који спроводи истрагу. Једном кад имају, потребно је створити графикон (калибрациону криву) који се суочава са две вредности на својим осама: апсорбанција у односу на микрограме протеина. Из криве генерисане са вредностима, оне се могу екстраполовати да би се добила тачна концентрација протеина у раствору.

Предност

Брадфордову методу је врло лако извести за све који су повезани са лабораторијским пољем, пошто се сваки биолог и хемичар током својих година студија суочио са спектрофотометром са најмање једним време. Било да се измери количина хлорофила у раствору услед дробљења листа (типично) много сложенијим стварима, спектрофотометри су веома раширени у областима учење.

Поред своје лакоће, Треба напоменути да многи протеини у свом природном стању имају изузетно низак опсег апсорпције, на 280 нм. Чак ни сви протеини не достижу ову вредност, јер за то морају имати специфичне аминокиселине (тирозин, фенилаланин и триптофан), које нису увек присутне. Како је ова вредност упијања у УВ опсегу, потребна је посебна машина коју готово нико не мора да третира.

Стварно, оно што се ради у Брадфордовој методи је да се „повећа“ вредност апсорбанције протеина везивањем за боју. Поред тога што су много лакши за читање у овом стању, протеини се одмичу од спектра апсорбанције других биолошких молекула, који би могли контаминирати узорак.

Резиме

На овом малом часу хемије уронили смо у једну од најједноставнијих и најједноставнијих метода за квантификацију протеина, под условом да је доступан одговарајући материјал. У сваком случају, морамо нагласити да, као и све у овом животу, ни он није савршен и непогрешив: обично је потребно направити вишеструке разблажења узорка за анализу (минималне и максималне вредности од 0 µг / мЛ до 2000 µг / мЛ), што може довести до грешака током процес.

Даље, присуство детерџената и других једињења у раствору може спречити правилан развој методе. Срећом, постоје и други реагенси који се могу додати мешавини за решавање ових проблема у многим случајевима.

Библиографске референце:

• Цомптон, С. Ј., & Јонес, Ц. Г. (1985). Механизам одговора и интерференције боје у Брадфордовом тесту протеина. Аналитичка биохемија, 151 (2), 369-374.
• Ернст, О., и Зор, Т. (2010). Линеаризација Брадфорд теста протеина. Часопис за визуелне експерименте: ЈоВЕ, (38).
• Фриеденауер, С., и Берлет, Х. Х. (1989). Осетљивост и варијабилност Брадфордовог теста протеина у присуству детерџената. Аналитичка биохемија, 178 (2), 263-268.
• Он, Ф. (2011). Брадфорд тест протеина. Био-протокол, е45-е45.
• Јонес, Ц. Г., Харе, Ј. Д., & Цомптон, С. Ј. (1989). Мерење биљних протеина Брадфорд тестом. Часопис за хемијску екологију, 15 (3), 979-992.
• Лопез, Ј., Империал, С., Валдеррама, Р., и Наварро, С. (1993). Побољшани Брадфорд тест протеина на протеине колагена. Цлиница цхимица ацта, 220 (1), 91-100.
• Зор, Т., и Селингер, З. (1996). Линеаризација Брадфордовог теста протеина повећава његову осетљивост: теоријске и експерименталне студије. Аналитичка биохемија, 236 (2), 302-308.