Bradford-metoden: vad det är och hur det fungerar

Proteiner är makromolekyler som består av aminosyror. Cirka 500 olika aminosyror har beskrivits i naturen, men märkligt nog är det bara 20 som är väsentliga i människokroppen. DNA innehåller all information som krävs för att ett protein ska syntetiseras, sedan genom mekanismer för transkription och translation, omvandlas en triplett av DNA-nukleotider till en aminosyra betong.

Ribosomer är de organeller som är ansvariga för att samla dessa aminosyror, vilket ger upphov till kedjor med varierande ordning och längd, eller vad är detsamma, det vi känner till proteiner. Dessa biomolekyler är väsentliga för att få liv, eftersom de står för cirka 80% av det torra protoplasman i varje cell och representerar 50% av vikten i alla levande vävnader.

Med dessa uppgifter i handen är det mer än klart för oss vikten av proteiner i generationen av liv. Idag kommer vi för att ge dig en mycket intressant mekanism relaterad till detta ämne, för vi berättar allt om Bradfords metod, utformad för att kvantifiera proteinkoncentrationen i en lösning.

• Relaterad artikel: "Vad är den vetenskapliga metoden och hur fungerar den?"

Vad är Bradford-metoden?

Bradford-metoden (känd som Bradfords proteinuppsats på engelska) beskrevs, som namnet antyder, av den amerikanska forskaren Marion Mckinley Bradford 1976. Först och främst är det nödvändigt att betona det Det är en spektrometrisk metod, en term som omfattar en uppsättning laboratorieprocedurer baserade på interaktionen mellan elektromagnetisk strålning och en analyt (den komponent av intresse som du vill separera från matrisen).

Utöver detta bör det noteras att det är en metod av kolorimetrisk natur, det vill säga det uppnår resultat baserat på färger och deras koncentration i en specifik lösning. Nyckeln till detta terminologiska konglomerat finns i färgämnet "Coomassie blue", eftersom Bradford-metoden kvantifierar förändringarna i dess absorbans enligt vissa parametrar. Detta färgämne verkar blått i sin anjoniska form, grönt i sin neutrala form och rött i sin katjoniska form.

Under sura förhållanden i lösning blir Coomassie-blått från rött till blått och binds under processen till de proteiner som ska kvantifieras. Om det inte finns några proteiner i det vattenhaltiga mediet förblir blandningen brun, så det är mycket lätt att detektera närvaron av dessa makromolekyler i första hand med denna metod.

De kemiska baserna i Bradford-metoden

Vi går in i lite mer komplex terräng, eftersom det är dags att beskriva vad som händer mellan dessa molekyler bortom direkta färgförändringar. Vid sammanfogning med proteinet bildar Coomassieblått i sin katjoniska och dubbla protonerade form (röd) en mycket stark icke-kovalent bindning med nämnda makromolekyl., av van der waals krafter och elektrostatiska interaktioner.

Under bildandet av detta kemiska komplex donerar färgämnet till de joniserbara delarna av proteinet fri elektron (kom ihåg att katjon = positiv laddning, förlorar elektroner), vilket orsakar störning av proteintillståndet vanligt. Detta exponerar vissa ämnen som kan generera de tidigare beskrivna fackföreningarna, där vi inte kommer att sluta på grund av deras kemiska komplexitet. Sammanfattningsvis behöver du bara veta följande:

Rött färgämne (katjoniskt / inte bundet till protein) ≠ Blått färgämne (anjoniskt / bundet till protein)

Baserat på denna förutsättning bör det noteras att det röda färgämnet har ett absorptionsspektrum på 465 nm, ett värde som representerar den infallande elektromagnetiska strålningen som ett material absorberar inom ett frekvensområde. I den anjoniska blå formen (interagerar med proteiner) sker en förändring i absorptionen vid 595 nm. I en lösning som utsätts för Bradford-metoden görs därför avläsningar i spektrofotometrar inom ett område av 595 nm.

Ökningen i absorbans i detta spektrum är direkt proportionell mot antalet bindningar mellan färgämnet och proteinerna, så det gör det inte Det upptäcks bara att det finns proteiner med färgförändring, men det är också möjligt att uppskatta hur mycket protein det finns per milliliter medium flytande. Otroligt sant?

• Du kanske är intresserad av: "Laboratoriematerial: 23 viktiga föremål och instrument"

Bradford-metodförfarande

För att genomföra denna metod är en spektrofotometer nödvändig, vilket inte är exakt billigt (ungefär 2000 euro ungefär), så det är inte något som kan köras hemifrån. Denna maskin kan projicera en monokromatisk ljusstråle genom ett prov för att mäta mängden ljus som absorberas av intressanta föreningar. Således får forskaren information om molekylernas natur i lösningen i fråga och kan för övrigt också beräkna molekylens koncentration.

Vidare bör det noteras att reagenset inte bara är "rå" Coomassie-blått. 100 mg färgämne bör lösas i 50 ml 95% etanollösning och 100 ml 85% fosforsyra tillsättas. Dessutom är det nödvändigt att späda ut det till en liter när färgämnet har lösts upp och filtrera blandningen för att ge upphov till det definitiva reagens som används i metoden. Färgen på denna lösning utan proteiner närvarande, som vi har sagt, bör vara brunaktig.

När forskaren har reagenset och spektrofotometern måste han följa följande steg:

• Förbered spektrofotometern och kontrollera att den fungerar korrekt.
• Förbered den proteinlösning som ska analyseras. Helst bör detta prov innehålla mellan 5 och 100 mikrogram protein per 100 mikroliter total lösning. Det är uppenbart att den exakta koncentrationen inte är känd, men de är max- och minimivärdena.
• Förbered standarder. Vi kommer inte att gå in på deras särdrag på grund av den kemiska komplikation de medför.
• Tillsätt 5 ml reagens till lösningen och låt den inkubera i 5 minuter.
• Mät absorbans av blandningen på spektrofotometern vid 595 nm.

Resultaten kommer att visas på spektrofotometern och bör noteras av den professionella som genomför undersökningen. När de väl har det är nödvändigt att skapa en graf (kalibreringskurva) som står inför två värden på deras axlar: absorbans mot mikrogram protein. Från den kurva som genereras med värdena kan dessa extrapoleras för att erhålla den exakta koncentrationen av protein i lösningen.

Fördel

Bradford-metoden är mycket lätt att utföra för alla som är relaterade till laboratoriefältet, eftersom varje biolog och kemist har utsatts för en spektrofotometer under sina studieår minst en tid. Antingen för att mäta mängden klorofyll i en lösning från krossning av ett blad (typiskt) för mycket mer komplexa saker är spektrofotometrar mycket utbredda inom inlärning.

Förutom dess lätthet, Det bör noteras att många proteiner i deras naturliga tillstånd har ett extremt lågt absorptionsområde vid 280 nm. Inte ens alla proteiner når detta värde, för för detta måste de ha specifika aminosyror (tyrosin, fenylalanin och tryptofan), som inte alltid är närvarande. Eftersom denna absorbanssiffra ligger inom UV-området är det nödvändigt med en speciell maskin som nästan ingen behöver behandla dem.

Verkligen, vad som görs i Bradford-metoden är att "öka" proteins absorbansvärde genom att binda till ett färgämne. Förutom att det är mycket lättare att läsa i detta tillstånd, rör sig proteinerna bort från absorbansspektren för andra biologiska molekyler, vilket kan förorena provet.

Återuppta

I den här lilla kemiklassen har vi fördjupat oss i en av de enklaste och enklaste proteinkvantifieringsmetoderna att utföra, förutsatt att det relevanta materialet är tillgängligt. I vilket fall som helst måste vi betona att det, precis som allt i det här livet, inte är perfekt och ofelbart: det är vanligtvis nödvändigt att göra flera utspädningar av provet för analys (minimi- och maximivärden på 0 µg / ml till 2000 µg / ml), vilket kan leda till fel under processen.

Vidare kan närvaron av detergenter och andra föreningar i lösningen förhindra en korrekt utveckling av metoden. Lyckligtvis finns det andra reagens som kan tillsättas blandningen för att lösa dessa problem i många fall.

Bibliografiska referenser:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mekanism för färgämnesrespons och störningar i Bradford-proteinanalysen. Analytisk biokemi, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Linearisering av Bradford-proteinanalysen. Journal of visualized experiment: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Känslighet och variation i Bradford-proteinanalysen i närvaro av tvättmedel. Analytisk biokemi, 178 (2), 263-268.
• Han f. (2011). Bradford-proteinanalys. Bioprotokoll, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Mätning av växtprotein med Bradford-analysen. Journal of chemical ecology, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). En förbättrad Bradford-proteinanalys för kollagenproteiner. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearisering av Bradford-proteinanalysen ökar dess känslighet: teoretiska och experimentella studier. Analytisk biokemi, 236 (2), 302-308.