Бредфордський метод: що це і як він працює

Білки - це макромолекули, що складаються з амінокислот. У природі описано близько 500 різних амінокислот, але цікаво, що лише 20 є найважливішими, присутніми в організмі людини. ДНК містить всю інформацію, необхідну для синтезу білка, починаючи з механізми транскрипції та трансляції, триплет нуклеотидів ДНК перетворюється на амінокислоту бетон.

Рибосоми - це органели, що відповідають за збирання цих амінокислот, утворюючи ланцюги зі змінним порядком і довжиною, або те саме, що ми знаємо як білки. Ці біомолекули необхідні для зачаття життя, оскільки на них припадає приблизно 80% сухої протоплазми в кожній клітині і становлять 50% ваги у всіх живих тканинах.

Маючи ці дані в руках, нам більш ніж ясно, яке значення мають білки у житті. Сьогодні ми прийшли, щоб представити вам дуже цікавий механізм, пов’язаний з цією темою, тому що ми розповімо вам все про Метод Бредфорда, призначений для кількісної оцінки концентрації білка в розчині.

• Пов’язана стаття: "Що таке науковий метод і як він працює?"

Що таке метод Бредфорда?

Метод Бредфорда (відомий як англомовний нарис про білки Бредфорда) був описаний, як випливає з назви, американською вченою Маріон Макінлі Бредфорд у 1976 році. Перш за все, на цьому слід наголосити Це спектрометричний метод, термін, який охоплює набір лабораторних процедур, заснованих на взаємодії електромагнітного випромінювання з аналітом (інтересний компонент, який ви хочете відокремити від матриці).

На додаток до цього слід зазначити, що це метод колориметричного характеру, тобто той отримує результати на основі кольорів та їх концентрації у конкретному розчині. Ключ до цього термінологічного конгломерату знаходиться в барвнику «Кумасі синій», оскільки метод Бредфорда кількісно визначає зміни його поглинання за певними параметрами. Цей барвник виглядає синім у своїй аніонній формі, зеленим у нейтральній формі та червоним у катіонній формі.

У кислих умовах у розчині синій кумасі перетворюється з червоного на синій і в процесі зв’язується з білками, які підлягають кількісному визначенню. Якщо у водному середовищі немає білків, суміш залишається коричневою, тому виявити присутність цих макромолекул дуже легко за допомогою цієї методології.

Хімічні основи методу Бредфорда

Ми виходимо на дещо складніший рельєф, оскільки настав час описати, що відбувається між цими молекулами, окрім прямих змін кольору. Приєднуючись до білка, синій кумасі у своїй катіонній та подвійно протонованій формі (червоний) утворює дуже міцний нековалентний зв’язок із зазначеною макромолекулою., за силами ван дер Ваальса та електростатичними взаємодіями.

Під час утворення цього хімічного комплексу барвник віддає іонізуючим частинам білка своє вільний електрон (пам’ятайте, що катіон = позитивний заряд, втрачає електрони), що спричиняє порушення білкового стану нормальний. Це відкриває певні речовини, які можуть утворювати описані раніше союзи, в яких ми не збираємось зупинятися через їх хімічну складність. Таким чином, вам потрібно знати лише таке:

Червоний барвник (катіонний / не зв’язаний з білком) ≠ Синій барвник (аніонний / зв’язаний з білком)

Виходячи з цієї передумови, слід зазначити, що червоний барвник має спектр поглинання 465 нм, значення, яке представляє падаюче електромагнітне випромінювання, яке матеріал поглинає в діапазоні частот. В аніонно-блакитній формі (взаємодіючи з білками) зміна поглинання відбувається при 595 нм. Отже, у розчині, підданому методу Бредфорда, зчитування проводиться в спектрофотометрах в діапазоні 595 нм.

Збільшення поглинання в цьому спектрі прямо пропорційно кількості зв’язків між барвником і білками, тому це не Виявляється лише наявність білків із зміною кольору, але також можна оцінити, скільки білка міститься на мілілітр середовища рідина. Неймовірно правда?

• Вас можуть зацікавити: "Лабораторний матеріал: 23 необхідні предмети та інструменти"

Процедура методу Бредфорда

Для проведення цієї методики необхідний спектрофотометр, який коштує не зовсім дешево (приблизно 2000 євро), тож це не те, що можна запускати з дому. Ця машина здатна проектувати монохроматичний промінь світла через зразок, щоб виміряти кількість світла, яке поглинається цікавими сполуками. Таким чином, дослідник отримує інформацію про природу молекул у розчині, про який йде мова, і, до речі, він також може обчислити концентрацію згаданої молекули.

Крім того, слід зазначити, що реагент є не просто "сирим" синім кумасі. 100 міліграмів барвника слід розчинити в 50 мілілітрах 95% -ного розчину етанолу та додати 100 мілілітрів 85% фосфорної кислоти. Крім того, необхідно розбавити його до літра, як тільки барвник розчиниться, і відфільтрувати суміш, щоб отримати остаточний реагент, що використовується в способі. Колір цього розчину без присутніх білків, як ми вже говорили, повинен бути коричневим.

Після того, як дослідник отримав реагент і спектрофотометр, він повинен виконати такі дії:

• Підготуйте спектрофотометр і перевірте його правильну роботу.
• Приготуйте аналізований розчин білка. В ідеалі ця проба повинна містити від 5 до 100 мікрограмів білка на 100 мікролітрів загального розчину. Очевидно, що точні концентрації невідомі, але вони є максимальними та мінімальними значеннями.
• Підготувати стандарти. Ми не будемо вдаватися до їх особливостей через хімічне ускладнення, яке вони спричиняють.
• Додайте до розчину 5 мілілітрів реагенту і дайте йому інкубуватися протягом 5 хвилин.
• Виміряйте поглинання суміші на спектрофотометрі при 595 нм.

Результати з’являться на екрані спектрофотометра, і їх повинен зазначати фахівець, який проводить дослідження. Як тільки вони необхідно створити графік (калібрувальну криву), який має два значення по осях: абсорбція проти мікрограмів білка. З кривої, сформованої зі значеннями, їх можна екстраполювати, щоб отримати точну концентрацію білка в розчині.

Перевага

Метод Бредфорда дуже простий у виконанні для тих, хто має відношення до лабораторної галузі, оскільки кожен біолог і хімік стикався із спектрофотометром за роки навчання хоча б з одним час. Або для вимірювання кількості хлорофілу в розчині від подрібнення листа (типово) до набагато складніших речей спектрофотометри дуже широко поширені в областях Росії навчання.

Окрім простоти, Слід зазначити, що багато білків у своєму природному стані мають надзвичайно низький діапазон поглинання - 280 нм. Навіть не всі білки досягають цього значення, оскільки для цього вони повинні мати специфічні амінокислоти (тирозин, фенілаланін та триптофан), які присутні не завжди. Оскільки цей показник поглинання знаходиться в діапазоні УФ, для їх обробки необхідна спеціальна машина, якої майже ніхто не має.

Справді, те, що робиться в методі Бредфорда, полягає в "збільшенні" значення поглинання білків шляхом зв'язування з барвником. Окрім того, що білки набагато легше читати в такому стані, білки віддаляються від спектрів поглинання інших біологічних молекул, які можуть забруднити зразок.

Резюме

На цьому невеликому уроці хімії ми поринули в один із найпростіших та найпростіших методів кількісного визначення білка, за умови наявності відповідного матеріалу. У будь-якому випадку, ми повинні підкреслити, що, як і все в цьому житті, воно також не є ідеальним і безпомилковим: зазвичай потрібно розведення зразка для аналізу (мінімальні та максимальні значення від 0 мкг / мл до 2000 мкг / мл), що може призвести до помилок під час процес.

Крім того, присутність миючих засобів та інших сполук у розчині може перешкодити правильному розвитку способу. На щастя, є інші реагенти, які можна додавати до суміші для вирішення цих проблем у багатьох випадках.

Бібліографічні посилання:

• Комптон, С. Дж., & Джонс, К. Г. (1985). Механізм реакції барвника та інтерференція в аналізі Бредфорда на білки. Аналітична біохімія, 151 (2), 369-374.
• Ернст О. та Зор Т. (2010). Лінеаризація аналізу протеїну Бредфорда. Журнал візуалізованих експериментів: JoVE, (38).
• Фріденауер, С., і Берлет, Х. H. (1989). Чутливість та мінливість тесту Бредфорда на наявність білків у присутності миючих засобів. Аналітична біохімія, 178 (2), 263-268.
• Він, Ф. (2011). Бредфордський аналіз білка. Біо-протокол, e45-e45.
• Джонс, К. Г., Заєць, Дж. Д., & Комптон, С. Дж. (1989). Вимірювання рослинного білка за допомогою Бредфордського аналізу. Журнал хімічної екології, 15 (3), 979-992.
• Лопес, Дж., Імперіал, С., Вальдеррама, Р., & Наварро, С. (1993). Покращений Бредфордівський аналіз білка на колагенові білки. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Лінеаризація Бредфордського аналізу білка підвищує його чутливість: теоретичні та експериментальні дослідження. Аналітична біохімія, 236 (2), 302-308.