Bradfordo metodas: kas tai yra ir kaip jis veikia

Baltymai yra makromolekulės, sudarytos iš aminorūgščių. Gamtoje aprašyta apie 500 skirtingų amino rūgščių, tačiau įdomu, kad tik 20 yra būtiniausios žmogaus organizme. DNR yra visa informacija, reikalinga baltymui sintetinti, nes per transkripcijos ir transliacijos mechanizmai, DNR nukleotidų tripletas paverčiamas aminorūgštimi betonas.

Ribosomos yra organeliai, atsakingi už šių aminorūgščių susidarymą, sukurdami grandines, kurių eilės ir ilgis skiriasi, arba kas yra tas pats, ką mes žinome kaip baltymus. Šios biomolekulės yra būtinos norint įsivaizduoti gyvenimą, nes kiekvienoje ląstelėje jos sudaro apie 80% sausos protoplazmos ir sudaro 50% visų gyvų audinių svorio.

Turint šiuos duomenis, mums yra daugiau nei aišku baltymų svarba kuriant gyvenimą. Šiandien mes atnešime jums labai įdomų mechanizmą, susijusį su šia tema, nes mes jums viską papasakosime Bradfordo metodas, sukurta baltymo koncentracijai tirpalui įvertinti.

• Susijęs straipsnis: "Koks yra mokslinis metodas ir kaip jis veikia?"

Kas yra Bradfordo metodas?

Bradfordo metodą (anglų kalba vadinamą Bradfordo baltymų esė), kaip rodo jo pavadinimas, aprašė amerikiečių mokslininkė Marion Mckinley Bradford 1976 m. Visų pirma būtina tai pabrėžti Tai yra spektrometrinis metodas, terminas, apimantis laboratorinių procedūrų rinkinį, pagrįstą elektromagnetinės spinduliuotės sąveika su analite (dominantis komponentas, kurį norite atskirti nuo matricos).

Be to, reikia pažymėti, kad tai yra kolorimetrinio pobūdžio metodas, t gauna rezultatus pagal spalvas ir jų koncentraciją konkrečiame tirpale. Šio terminologinio konglomerato raktas yra „Coomassie blue“ dažuose, nes Bradfordo metodas kiekybiškai apibūdina jo absorbcijos pokyčius pagal tam tikrus parametrus. Šis dažiklis yra mėlynas anijoninės formos, žalias - neutralios formos, raudonas - katijoninės formos.

Esant rūgštinėms tirpalo sąlygoms, Coomassie mėlyna spalva iš raudonos virsta mėlyna ir proceso metu prisijungia prie baltymų, kuriuos reikia nustatyti. Jei vandeninėje terpėje nėra baltymų, mišinys išlieka rudas, todėl naudojant šią metodiką labai lengva nustatyti šių makromolekulių buvimą.

Cheminės Bradfordo metodo bazės

Mes einame į šiek tiek sudėtingesnį reljefą, nes laikas aprašyti, kas vyksta tarp šių molekulių, be tiesioginių spalvų pokyčių. Prisijungdama su baltymais, Coomassie mėlyna katijoninėje ir dviguboje protonuotoje formoje (raudona) sukuria labai stiprų nekovalentinį ryšį su minėta makromolekule., van der valso jėgomis ir elektrostatine sąveika.

Susidarant šiam cheminiam kompleksui, dažai paaukoja jonizuojamas jo baltymo dalis laisvas elektronas (atminkite, kad katijonas = teigiamas krūvis, praranda elektronus), dėl kurio sutrinka baltymų būsena normalus. Tai atskleidžia tam tikras medžiagas, kurios gali sukelti anksčiau aprašytas sąjungas, kurių mes neketiname sustabdyti dėl jų cheminio sudėtingumo. Apibendrinant reikia žinoti tik šiuos dalykus:

Raudoni dažai (katijoniniai / nesusiję su baltymais) ≠ Mėlyni dažai (anijoniniai / susijungę su baltymais)

Remiantis šia prielaida, reikia pažymėti, kad raudonojo dažo absorbcijos spektras yra 465 nm, tai vertė, atspindinti krintančią elektromagnetinę spinduliuotę, kurią medžiaga sugeria dažnių diapazone. Anijoninės mėlynos formos (sąveikaujančios su baltymais) absorbcijos pokytis įvyksta esant 595 nm. Todėl tirpale, kuriam taikomas Bradfordo metodas, spektrofotometru rodmenys rodomi 595 nm diapazone.

Absorbcijos padidėjimas šiame spektre yra tiesiogiai proporcingas ryšių tarp dažų ir baltymų skaičiui, todėl jis neturi Tik nustatoma, kad yra baltymų, pasikeitus spalvai, tačiau taip pat galima įvertinti, kiek baltymų yra mililitre terpės skystas. Neįtikėtina tiesa?

• Jus gali sudominti: „Laboratorinė medžiaga: 23 pagrindiniai daiktai ir instrumentai“

Bradfordo metodo procedūra

Norint atlikti šią metodiką, reikalingas spektrofotometras, kuris nėra visai pigus (apytiksliai 2 000 eurų), taigi tai nėra kažkas, kurį galima paleisti iš namų. Ši mašina per mėginį gali projektuoti monochromatinį šviesos pluoštą, kad būtų galima išmatuoti šviesos kiekį, kurį sugeria dominantys junginiai. Taigi tyrėjas gauna informaciją apie aptariamame tirpale esančių molekulių pobūdį, beje, taip pat sugeba apskaičiuoti minėtos molekulės koncentraciją.

Be to, reikėtų pažymėti, kad reagentas yra ne tik „žalias“ Coomassie mėlynasis. 100 miligramų dažų reikia ištirpinti 50 mililitrų 95% etanolio tirpalo ir pridėti 100 mililitrų 85% fosforo rūgšties. Be to, ištirpinus dažiklį, jį reikia praskiesti iki vieno litro ir mišinį filtruoti, kad gautų galutinį reagentą, naudojamą šiame metode. Šio tirpalo, kuriame nėra baltymų, spalva, kaip sakėme, turėtų būti rusvos spalvos.

Kai tyrėjas turi reagentą ir spektrofotometrą, jis turi atlikti šiuos veiksmus:

• Paruoškite spektrofotometrą ir patikrinkite, ar jis veikia tinkamai.
• Paruoškite analizuojamą baltymų tirpalą. Idealiu atveju šiame mėginyje turėtų būti nuo 5 iki 100 mikrogramų baltymų 100 mikrolitrų viso tirpalo. Akivaizdu, kad tiksli koncentracija nėra žinoma, tačiau jos yra didžiausios ir mažiausios vertės.
• Paruoškite standartus. Mes nesigilinsime į jų ypatumus dėl jų sukeliamų cheminių komplikacijų.
• Į tirpalą įpilkite 5 mililitrus reagento ir leiskite jam inkubuotis 5 minutes.
• Spektrofotometru išmatuokite mišinio absorbciją esant bangos ilgiui 595 nm.

Rezultatai bus rodomi spektrofotometro ekrane, juos turėtų pažymėti tyrimą atliekantis profesionalas. Kai jie turės, būtina sukurti grafiką (kalibravimo kreivę), kurio ašyse būtų dvi vertės: absorbcija ir mikrogramai baltymų. Iš kreivės, gautos su vertėmis, jas galima ekstrapoliuoti, norint gauti tikslią baltymo koncentraciją tirpale.

Privalumas

Bradfordo metodą labai lengva atlikti visiems, susijusiems su laboratorijos sritimi, kadangi kiekvienas biologas ir chemikas per vienerius studijų metus susidūrė su spektrofotometru laikas. Arba norint išmatuoti chlorofilo kiekį tirpale susmulkinant lapą (būdinga) daug sudėtingesnių dalykų, spektrofotometrai yra labai paplitę mokymasis.

Be savo lengvumo, Reikėtų pažymėti, kad daugelio baltymų, esančių natūralioje būsenoje, absorbcijos diapazonas yra ypač mažas, esant 280 nm bangos ilgiui. Net visi baltymai nepasiekia šios vertės, nes tam jie turi turėti specifinių amino rūgščių (tirozino, fenilalanino ir triptofano), kurių nėra visada. Kadangi ši absorbcijos vertė yra UV diapazone, būtina speciali mašina, kurios beveik niekas neturi gydyti.

Tikrai, tai, kas daroma taikant Bradfordo metodą, yra „padidinti“ baltymų absorbcijos vertę prisijungiant prie dažų. Be to, kad tokioje būsenoje baltymai yra daug lengviau skaitomi, jie nutolsta nuo kitų biologinių molekulių absorbcijos spektrų, kurie gali užteršti mėginį.

Tęsti

Šioje mažoje chemijos klasėje pasinėrėme į vieną iš paprasčiausių ir lengviausių baltymų kiekybinio įvertinimo metodų, jei yra atitinkamos medžiagos. Bet kokiu atveju turime pabrėžti, kad, kaip ir viskas šiame gyvenime, jis taip pat nėra tobulas ir neklystantis: paprastai reikia padaryti kelis analizei skirto mėginio praskiedimai (mažiausios ir didžiausios vertės nuo 0 µg / ml iki 2000 µg / ml), o tai gali sukelti klaidų procesas.

Be to, ploviklių ir kitų junginių buvimas tirpale gali užkirsti kelią teisingam metodo vystymuisi. Laimei, yra kitų reagentų, kuriuos galima pridėti į mišinį, kad daugeliu atvejų būtų išspręstos šios problemos.

Bibliografinės nuorodos:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Bradfordo baltymų tyrimo dažų reakcijos ir trukdžių mechanizmas. Analitinė biochemija, 151 (2), 369-374.
• Ernstas, O., ir Zoras, T. (2010). Bradfordo baltymų tyrimo linearizavimas. Vizualizuotų eksperimentų žurnalas: JoVE, (38).
• Friedenauer, S. ir Berlet, H. H. (1989). Bradfordo baltymų tyrimo jautrumas ir kintamumas esant detergentams. Analitinė biochemija, 178 (2), 263-268.
• Jis, F. (2011). Bradfordo baltymų tyrimas. Bioprotokolas, e45-e45.
• Jonesas, C. G., Kiškis, Dž. D., & Compton, S. Dž. (1989). Augalinių baltymų matavimas Bradfordo tyrimu. Cheminės ekologijos leidinys, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Patobulintas kolageno baltymų Bradfordo baltymų tyrimas. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zoras, T., ir Selingeris, Z. (1996). Bradfordo baltymų tyrimo linearizavimas padidina jo jautrumą: teoriniai ir eksperimentiniai tyrimai. Analitinė biochemija, 236 (2), 302-308.