Bradford-methode: wat het is en hoe het werkt

Eiwitten zijn macromoleculen die zijn opgebouwd uit aminozuren. In de natuur zijn ongeveer 500 verschillende aminozuren beschreven, maar interessant genoeg zijn er slechts 20 de essentiële die in het menselijk lichaam aanwezig zijn. DNA bevat alle informatie die nodig is om een ​​eiwit te synthetiseren, omdat transcriptie- en translatiemechanismen, wordt een DNA-nucleotide-triplet omgezet in een aminozuur beton.

Ribosomen zijn de organellen die verantwoordelijk zijn voor het samenstellen van deze aminozuren, die aanleiding geven tot ketens met variabele volgorde en lengte, of wat hetzelfde is, wat we kennen als eiwitten. Deze biomoleculen zijn essentieel om het leven te verwekken, aangezien ze ongeveer 80% van het droge protoplasma in elke cel uitmaken en 50% van het gewicht in alle levende weefsels vertegenwoordigen.

Met deze gegevens in de hand is het ons meer dan duidelijk hoe belangrijk eiwitten zijn bij het ontstaan ​​van leven. Vandaag komen we je een heel interessant mechanisme brengen met betrekking tot dit onderwerp, omdat we je alles zullen vertellen over

De methode van Bradford, ontworpen om de eiwitconcentratie van een oplossing te kwantificeren.

• Gerelateerd artikel: "Wat is de wetenschappelijke methode en hoe werkt het?"

Wat is de Bradford-methode?

De Bradford-methode (in het Engels bekend als Bradfords eiwitessay) werd, zoals de naam al doet vermoeden, in 1976 beschreven door de Amerikaanse wetenschapper Marion Mckinley Bradford. Allereerst moet worden benadrukt dat: Het is een spectrometrische methode, een term die een reeks laboratoriumprocedures omvat die gebaseerd zijn op de interactie van elektromagnetische straling met een analyt (de component van belang die u wilt scheiden van de matrix).

Daarnaast moet worden opgemerkt dat het een methode van colorimetrische aard is, dat wil zeggen: verkrijgt resultaten op basis van kleuren en hun concentratie in een specifieke oplossing. De sleutel tot dit terminologische conglomeraat is te vinden in de "Coomassie blue"-kleurstof, aangezien de Bradford-methode de veranderingen in de absorptie kwantificeert volgens bepaalde parameters. Deze kleurstof lijkt blauw in zijn anionische vorm, groen in zijn neutrale vorm en rood in zijn kationische vorm.

Onder zure omstandigheden in oplossing verandert Coomassie-blauw van rood in blauw en bindt zich daarbij aan de te kwantificeren eiwitten. Als er geen eiwitten in het waterige medium zitten, blijft het mengsel bruin, dus het is met deze methode heel gemakkelijk om in eerste instantie de aanwezigheid van deze macromoleculen te detecteren.

De chemische basis van de Bradford-methode

We betreden een wat complexer terrein, omdat het tijd is om te beschrijven wat er tussen deze moleculen gebeurt naast directe kleurveranderingen. Bij het verbinden met het eiwit vormt Coomassie-blauw in zijn kationische en dubbel geprotoneerde vorm (rood) een zeer sterke niet-covalente binding met genoemd macromolecuul., door van der waals-krachten en elektrostatische interacties.

Tijdens de vorming van dit chemische complex geeft de kleurstof de ioniseerbare delen van het eiwit zijn vrij elektron (onthoud dat kation = positieve lading, elektronen verliest), waardoor de eiwittoestand wordt verstoord causes normaal. Dit legt bepaalde stoffen bloot die de eerder beschreven vakbonden kunnen genereren, waarbij we vanwege hun chemische complexiteit niet zullen stoppen. Samengevat hoeft u alleen het volgende te weten:

Rode kleurstof (kationisch / niet gebonden aan eiwit) ≠ Blauwe kleurstof (anionisch / gebonden aan eiwit)

Op basis van dit uitgangspunt moet worden opgemerkt dat: de rode kleurstof heeft een absorptiespectrum van 465 nm, een waarde die de invallende elektromagnetische straling vertegenwoordigt die een materiaal absorbeert binnen een reeks frequenties. In de anionische blauwe vorm (interactie met eiwitten) treedt een verandering in absorptie op bij 595 nm. Daarom worden in een oplossing onderworpen aan de Bradford-methode metingen gedaan in spectrofotometers bij een bereik van 595 nm.

De toename in absorptie in dit spectrum is recht evenredig met het aantal bindingen tussen de kleurstof en de eiwitten, dus dat is niet het geval Er wordt alleen gedetecteerd dat er eiwitten zijn met de kleurverandering, maar het is ook mogelijk om in te schatten hoeveel eiwit er per milliliter medium is vloeistof. Ongelooflijk waar?

• Mogelijk bent u geïnteresseerd in: "Laboratoriummateriaal: 23 essentiële objecten en instrumenten"

Bradford-methodeprocedure:

Om deze methode uit te voeren, is een spectrofotometer nodig, wat niet bepaald goedkoop is (ongeveer 2.000 euro ongeveer), dus het is niet iets dat vanuit huis kan worden uitgevoerd. Deze machine kan een monochromatische lichtstraal door een monster projecteren om de hoeveelheid licht te meten die wordt geabsorbeerd door de betreffende verbindingen. Zo krijgt de onderzoeker informatie over de aard van de moleculen in de betreffende oplossing en kan hij overigens ook de concentratie van dat molecuul berekenen.

Verder moet worden opgemerkt dat het reagens niet alleen "rauw" Coomassie-blauw is. 100 milligram van de kleurstof moet worden opgelost in 50 milliliter van een 95% ethanoloplossing en 100 milliliter 85% fosforzuur moet worden toegevoegd. Bovendien is het noodzakelijk om het te verdunnen tot een liter zodra de kleurstof is opgelost en het mengsel te filtreren, om het definitieve reagens te verkrijgen dat in de methode wordt gebruikt. De kleur van deze oplossing zonder aanwezige eiwitten, zoals we al zeiden, zou bruinachtig moeten zijn.

Zodra de onderzoeker het reagens en de spectrofotometer heeft, moet hij de volgende stappen volgen:

• Bereid de spectrofotometer voor en controleer de juiste werking.
• Bereid de te analyseren eiwitoplossing voor. Idealiter zou dit monster tussen de 5 en 100 microgram eiwit per 100 microliter totale oplossing moeten bevatten. Het is duidelijk dat de exacte concentratie niet bekend is, maar het zijn de maximale en minimale waarden.
• Bereid normen voor. We gaan niet in op hun eigenaardigheden vanwege de chemische complicatie die ze met zich meebrengen.
• Voeg 5 milliliter reagens toe aan de oplossing en laat deze 5 minuten incuberen.
• Meet de absorptie van het mengsel op de spectrofotometer bij 595 nm.

De resultaten verschijnen op het scherm van de spectrofotometer en moeten worden genoteerd door de professional die het onderzoek uitvoert. Zodra ze dat hebben, het is noodzakelijk om een ​​grafiek (kalibratiecurve) te maken met twee waarden op hun assen: absorptie versus microgram eiwit. Uit de curve die met de waarden wordt gegenereerd, kunnen deze worden geëxtrapoleerd om de exacte eiwitconcentratie in de oplossing te verkrijgen.

Voordeel

De Bradford-methode is zeer eenvoudig uit te voeren voor iedereen die te maken heeft met het laboratoriumveld, aangezien elke bioloog en chemicus tijdens zijn studiejaren minstens één spectrofotometer heeft gezien tijd. Ofwel om de hoeveelheid chlorofyl in een oplossing te meten door het pletten van een blad (typisch) tot veel complexere dingen, spectrofotometers zijn zeer wijdverbreid op het gebied van aan het leren.

Naast het gemak, Opgemerkt moet worden dat veel eiwitten in hun natuurlijke staat een extreem laag absorptiebereik hebben, bij 280 nm. Zelfs niet alle eiwitten halen deze waarde, omdat ze daarvoor specifieke aminozuren (tyrosine, fenylalanine en tryptofaan) moeten hebben, die niet altijd aanwezig zijn. Omdat dit absorptiecijfer in het UV-bereik ligt, is een speciale machine nodig die bijna niemand hoeft te behandelen.

Werkelijk, wat bij de Bradford-methode wordt gedaan, is de absorptiewaarde van eiwitten "verhogen" door zich aan een kleurstof te binden. Behalve dat ze in deze toestand veel gemakkelijker te lezen zijn, bewegen de eiwitten zich weg van de absorptiespectra van andere biologische moleculen, die het monster zouden kunnen verontreinigen.

Hervat

In deze kleine scheikundeles hebben we ons ondergedompeld in een van de eenvoudigste en gemakkelijkste eiwitkwantificatiemethoden om uit te voeren, op voorwaarde dat het relevante materiaal beschikbaar is. We moeten in ieder geval benadrukken dat het, zoals alles in dit leven, ook niet perfect en onfeilbaar is: het is meestal nodig om meerdere verdunningen van het monster voor analyse (minimale en maximale waarden van 0 µg/ml tot 2000 µg/ml), wat kan leiden tot fouten tijdens het proces.

Verder kan de aanwezigheid van detergenten en andere verbindingen in de oplossing een correcte ontwikkeling van de methode in de weg staan. Gelukkig zijn er andere reagentia die aan de mix kunnen worden toegevoegd om deze problemen in veel gevallen op te lossen.

Bibliografische referenties:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mechanisme van kleurstofrespons en interferentie in de Bradford-eiwittest. Analytische biochemie, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O., & Zor, T. (2010). Linearisatie van de Bradford-eiwittest. Dagboek van gevisualiseerde experimenten: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Gevoeligheid en variabiliteit van de Bradford-eiwittest in aanwezigheid van detergentia. Analytische biochemie, 178 (2), 263-268.
• hij, f (2011). Bradford-eiwittest. Bio-protocol, e45-e45.
• Jones, C. G., Haas, J. D., & Compton, S. J. (1989). Plantaardig eiwit meten met de Bradford-assay. Tijdschrift voor chemische ecologie, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Een verbeterde Bradford-eiwittest voor collageeneiwitten. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearisatie van de Bradford-eiwittest verhoogt de gevoeligheid ervan: theoretische en experimentele studies. Analytische biochemie, 236 (2), 302-308.