Bradfordova metóda: čo to je a ako to funguje

Bielkoviny sú makromolekuly zložené z aminokyselín. V prírode bolo opísaných asi 500 rôznych aminokyselín, ale je zvláštne, že iba 20 z nich je nevyhnutných v ľudskom tele. DNA obsahuje všetky informácie potrebné na syntézu proteínu, a to až do konca mechanizmy transkripcie a translácie sa triplet nukleotidov DNA premení na aminokyselinu betón.

Ribozómy sú organely zodpovedné za zostavenie týchto aminokyselín, ktoré vedú k vzniku reťazcov s rôznym poradím a dĺžkou, alebo čo je to isté, čo poznáme ako proteíny. Tieto biomolekuly sú nevyhnutné pre počatie života, pretože tvoria približne 80% suchej protoplazmy v každej bunke a predstavujú 50% hmotnosti vo všetkých živých tkanivách.

S týmito údajmi v ruke je nám viac ako zrejmé dôležitosť bielkovín pre generáciu života. Dnes vám prichádzame, aby sme vám priniesli veľmi zaujímavý mechanizmus súvisiaci s touto témou, pretože vám povieme všetko o Bradfordova metóda, určené na kvantifikáciu koncentrácie proteínu v roztoku.

• Súvisiaci článok: „Aká je vedecká metóda a ako funguje?“

Aká je Bradfordova metóda?

Bradfordovu metódu (v angličtine známu ako Bradfordsova proteínová esej) popísal, ako naznačuje jej názov, americká vedkyňa Marion Mckinley Bradfordová v roku 1976. Najskôr je potrebné zdôrazniť, že Je to spektrometrická metóda, pojem, ktorý zahŕňa súbor laboratórnych postupov založených na interakcii elektromagnetického žiarenia s analytom. (komponent záujmu, ktorý chcete oddeliť od matice).

Okrem toho je potrebné poznamenať, že ide o metódu kolorimetrickej povahy, to znamená, že získava výsledky na základe farieb a ich koncentrácie v konkrétnom roztoku. Kľúč k tomuto terminologickému konglomerátu sa nachádza v farbive „Coomassie blue“, pretože Bradfordova metóda kvantifikuje zmeny jeho absorbancie podľa určitých parametrov. Toto farbivo sa javí ako modré vo svojej aniónovej forme, zelené v neutrálnej forme a červené vo svojej katiónovej forme.

Za kyslých podmienok v roztoku sa modrá Coomassie mení z červenej na modrú a pri tomto procese sa viaže na proteíny, ktoré sa majú kvantifikovať. Ak vo vodnom médiu nie sú žiadne proteíny, zmes zostáva hnedá, takže pomocou tejto metodiky je v prvom prípade veľmi ľahké zistiť prítomnosť týchto makromolekúl.

Chemické základy Bradfordovej metódy

Vstupujeme do trochu zložitejšieho terénu, pretože je čas popísať, čo sa medzi týmito molekulami deje, okrem priamych farebných zmien. Pri spájaní s proteínom vytvára Coomassie modrá vo svojej katiónovej a dvojitej protonovanej forme (červená) veľmi silnú nekovalentnú väzbu s uvedenou makromolekulou., van der Waalsovými silami a elektrostatickými interakciami.

Počas tvorby tohto chemického komplexu poskytuje farbivo ionizovateľné časti proteínu voľný elektrón (nezabudnite, že katión = kladný náboj, stráca elektróny), čo spôsobuje narušenie proteínového stavu normálne. To vystavuje určité látky, ktoré môžu vytvárať predtým opísané únie, v ktorých sa kvôli chemickej zložitosti nezastavíme. Stručne povedané, potrebujete iba nasledujúce informácie:

Červené farbivo (katiónové / neviazané na bielkoviny) ≠ Modré farbivo (aniónové / viazané na bielkoviny)

Na základe tohto predpokladu je potrebné poznamenať, že červené farbivo má absorpčné spektrum 465 nm, čo predstavuje dopadajúce elektromagnetické žiarenie, ktoré materiál absorbuje v rozsahu frekvencií. V aniónovej modrej forme (interagujúcej s proteínmi) nastáva zmena absorpcie pri 595 nm. Preto sa v roztoku podrobenom Bradfordovej metóde odčítajú hodnoty v spektrofotometroch pri rozmedzí 595 nm.

Zvýšenie absorpcie v tomto spektre je priamo úmerné počtu väzieb medzi farbivom a proteínmi, takže Zistilo sa iba to, že existujú proteíny so zmenou farby, ale dá sa tiež odhadnúť, koľko bielkovín je na mililiter média tekutý. Neuveriteľné pravda?

• Mohlo by vás zaujímať: „Laboratórny materiál: 23 základných predmetov a nástrojov“

Bradfordova metóda

Na uskutočnenie tejto metodiky je potrebný spektrofotometer, ktorý nie je práve lacný (približne 2 000 eur), takže nejde o nič, čo by sa dalo spustiť z domu. Tento prístroj je schopný premietať monochromatický lúč svetla cez vzorku na meranie množstva svetla, ktoré je absorbované predmetnými zlúčeninami. Vedec teda dostáva informácie o povahe molekúl v príslušnom roztoku a mimochodom je tiež schopný vypočítať koncentráciu uvedenej molekuly.

Ďalej je potrebné poznamenať, že činidlo nie je iba „surová“ Coomassie modrá. 100 miligramov farbiva by sa malo rozpustiť v 50 mililitroch 95% -ného etanolového roztoku a malo by sa pridať 100 mililitrov 85% -nej kyseliny fosforečnej. Okrem toho je potrebné ho po rozpustení farbiva zriediť na liter a zmes prefiltrovať, aby sa získalo konečné činidlo použité v metóde. Farba tohto roztoku bez prítomných bielkovín, ako sme už povedali, by mala byť hnedastá.

Keď má výskumný pracovník reagenciu a spektrofotometer, musí postupovať podľa týchto krokov:

• Pripravte spektrofotometer a skontrolujte jeho správnu činnosť.
• Pripravte proteínový roztok, ktorý sa má analyzovať. V ideálnom prípade by táto vzorka mala obsahovať od 5 do 100 mikrogramov bielkovín na 100 mikrolitrov celkového roztoku. Je zrejmé, že presná koncentrácia nie je známa, jedná sa však o maximálnu a minimálnu hodnotu.
• Pripravte štandardy. Nebudeme zachádzať do ich zvláštností kvôli ich chemickým komplikáciám.
• Do roztoku pridajte 5 ml činidla a nechajte ho inkubovať 5 minút.
• Zmerajte absorbanciu zmesi na spektrofotometri pri 595 nm.

Výsledky sa zobrazia na obrazovke spektrofotometra a mali by si ich všimnúť odborníci, ktorí vyšetrovanie vykonávajú. Akonáhle majú, je potrebné vytvoriť graf (kalibračnú krivku), ktorý stojí na dvoch osiach v jednej osi: absorbancia vs. mikrogramy proteínu. Z krivky generovanej s hodnotami je možné ich extrapolovať, aby sa získala presná koncentrácia proteínu v roztoku.

Výhoda

Bradfordova metóda je veľmi jednoduchá pre kohokoľvek, kto súvisí s laboratórnym odborom pretože každý biológ a chemik čelil počas svojich rokov štúdia spektrofotometru najmenej jednému čas. Buď na meranie množstva chlorofylu v roztoku po rozdrvení listu (typické) k oveľa zložitejším veciam sú spektrofotometre veľmi rozšírené v oblastiach učenie.

Okrem svojej ľahkosti Je potrebné poznamenať, že veľa proteínov v prirodzenom stave má extrémne nízky absorpčný rozsah pri 280 nm. Túto hodnotu nedosahujú ani všetky proteíny, pretože na to musia obsahovať špecifické aminokyseliny (tyrozín, fenylalanín a tryptofán), ktoré nie sú vždy prítomné. Pretože sa tento údaj o absorbancii nachádza v UV rozmedzí, je nevyhnutný špeciálny stroj, ktorý takmer nikto nemá, aby bol schopný ich ošetrovať.

Naozaj čo sa robí v Bradfordovej metóde, je „zvýšiť“ hodnotu absorbancie proteínov väzbou na farbivo. Okrem toho, že sú v tomto stave oveľa ľahšie čitateľné, proteíny sa vzďaľujú od absorpčného spektra iných biologických molekúl, ktoré by mohli kontaminovať vzorku.

Pokračovať

V tejto malej triede chémie sme sa ponorili do jednej z najjednoduchších a najjednoduchších metód kvantifikácie proteínov, ak je k dispozícii príslušný materiál. V každom prípade musíme zdôrazniť, že ako všetko v tomto živote, ani to nie je dokonalé a neomylné: zvyčajne je potrebné vytvoriť viac riedenia vzorky na analýzu (minimálne a maximálne hodnoty 0 µg / ml až 2 000 µg / ml), ktoré môžu viesť k chybám počas proces.

Okrem toho prítomnosť detergentov a iných zlúčenín v roztoku môže zabrániť správnemu vývoju metódy. Našťastie do zmesi môžu byť pridané ďalšie reagenty, ktoré v mnohých prípadoch vyriešia tieto problémy.

Bibliografické odkazy:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mechanizmus farbivovej reakcie a interferencie v Bradfordovom proteínovom teste. Analytical biochemistry, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O. a Zor, T. (2010). Linearizácia Bradfordovho proteínového testu. Časopis vizualizovaných experimentov: JoVE, (38).
• Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Citlivosť a variabilita Bradfordovho proteínového testu v prítomnosti detergentov. Analytical biochemistry, 178 (2), 263-268.
• On, F. (2011). Bradfordov proteínový test. Bioprotokol, e45-e45.
• Jones, C. G., Zajac, J. D., & Compton, S. J. (1989). Meranie rastlinných bielkovín pomocou Bradfordovho testu. Časopis chemickej ekológie, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). Vylepšený Bradfordov proteínový test na kolagénové proteíny. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. a Selinger, Z. (1996). Linearizácia Bradfordovho proteínového testu zvyšuje jeho citlivosť: teoretické a experimentálne štúdie. Analytical biochemistry, 236 (2), 302-308.