Bradfordova metoda: što je to i kako djeluje

Proteini su makromolekule sastavljene od aminokiselina. U prirodi je opisano oko 500 različitih aminokiselina, ali zanimljivo je da je samo 20 esencijalnih prisutnih u ljudskom tijelu. DNA sadrži sve informacije potrebne za sintezu proteina, od do Mehanizmi transkripcije i translacije, triplet DNA nukleotida pretvara se u aminokiselinu beton.

Ribosomi su organeli odgovorni za okupljanje ovih aminokiselina, što dovodi do stvaranja lanaca s redoslijedom i promjenjivom duljinom, ili što je isto, ono što mi znamo kao proteini. Te su biomolekule ključne za začeće života, jer čine oko 80% suhe protoplazme u svakoj stanici i predstavljaju 50% težine u svim živim tkivima.

Imajući ove podatke na raspolaganju, više nam je nego važna važnost proteina u stvaranju života. Danas vam donosimo vrlo zanimljiv mehanizam povezan s ovom temom, jer ćemo vam reći sve o tome Bradfordova metoda, dizajniran za kvantificiranje koncentracije proteina u otopini.

• Povezani članak: "Što je znanstvena metoda i kako djeluje?"

Što je Bradfordova metoda?

Bradfordovu metodu (na engleskom poznatu kao Bradfordsov esej o proteinima) opisala je američka znanstvenica Marion Mckinley Bradford 1976. godine, kao što joj i samo ime govori. Prije svega, to je potrebno naglasiti To je spektrometrijska metoda, pojam koji obuhvaća skup laboratorijskih postupaka koji se temelje na interakciji elektromagnetskog zračenja s analitom (komponenta od interesa koju želite odvojiti od matrice).

Uz ovo treba napomenuti da je to metoda kolorimetrijske prirode, odnosno ona dobiva rezultate na temelju boja i njihove koncentracije u određenoj otopini. Ključ ovog terminološkog konglomerata nalazi se u boji "Coomassie blue", budući da Bradfordova metoda kvantificira promjene njegove apsorpcije prema određenim parametrima. Ova boja izgleda plavo u svom anionskom obliku, zelena u neutralnom obliku i crvena u svom kationskom obliku.

U kiselim uvjetima u otopini, Coomassie plava boja prelazi iz crvene u plavu i pritom se veže na proteine ​​koje treba kvantificirati. Ako u vodenom mediju nema proteina, smjesa ostaje smeđa, pa je ovom metodologijom vrlo lako u prvom redu otkriti prisutnost tih makromolekula.

Kemijske osnove Bradfordove metode

Ulazimo na malo složeniji teren jer je vrijeme da opišemo što se događa između ovih molekula izvan izravnih promjena boje. Kada se spaja s bjelančevinom, Coomassie plavo u svom kationskom i dvostruko protoniranom obliku (crveno) tvori vrlo jaku nekovalentnu vezu s navedenom makromolekulom., van der waalsovim silama i elektrostatičkim interakcijama.

Tijekom stvaranja ovog kemijskog kompleksa, boja donira ionizirajuće dijelove proteina svoje slobodni elektron (sjetite se da je kation = pozitivan naboj, gubi elektrone), što uzrokuje poremećaj proteinskog stanja normalan. Ovo izlaže određene tvari koje mogu stvoriti prethodno opisane unije, u kojima se nećemo zaustaviti zbog njihove kemijske složenosti. Ukratko, trebate znati samo sljedeće:

Crvena boja (kationska / nevezana za protein) ≠ Plava boja (anionska / vezana za protein)

Na temelju ove premise treba napomenuti da crvena boja ima spektar apsorpcije od 465 nm, vrijednost koja predstavlja upadajuće elektromagnetsko zračenje koje materijal apsorbira unutar raspona frekvencija. U anionskom plavom obliku (u interakciji s proteinima) dolazi do promjene apsorpcije na 595 nm. Stoga se u otopini koja je podvrgnuta Bradfordovoj metodi očitavaju u spektrofotometrima u rasponu od 595 nm.

Povećanje apsorbancije u ovom spektru izravno je proporcionalno broju veza između boje i proteina, pa ne Otkriva se samo da postoje proteini s promjenom boje, ali također je moguće procijeniti koliko proteina ima po mililitru medija tekućina. Nevjerojatno istinito?

• Možda će vas zanimati: "Laboratorijski materijal: 23 bitna predmeta i instrumenti"

Postupak Bradfordove metode

Za provođenje ove metodologije potreban je spektrofotometar, koji nije baš jeftin (otprilike 2000 eura), pa nije nešto što se može pokrenuti od kuće. Ovaj stroj može projicirati monokromatski snop svjetlosti kroz uzorak, kako bi izmjerio količinu svjetlosti koju apsorbiraju spojevi od interesa. Dakle, istraživač prima informacije o prirodi molekula u dotičnoj otopini i, usput slučajno, također može izračunati koncentraciju spomenute molekule.

Nadalje, valja napomenuti da reagens nije samo "sirovo" Coomassie plavo. 100 miligrama boje treba otopiti u 50 mililitara 95% otopine etanola i dodati 100 mililitara 85% fosforne kiseline. Uz to, potrebno ga je razrijediti na litru nakon što se boja otopi i smjesu filtrirati, da se dobije konačni reagens koji se koristi u metodi. Boja ove otopine bez prisutnih bjelančevina, kao što smo rekli, trebala bi biti smećkasta.

Nakon što istraživač dobije reagens i spektrofotometar, mora slijediti sljedeće korake:

• Pripremite spektrofotometar i provjerite njegov ispravan rad.
• Pripremite otopinu proteina za analizu. Idealno bi bilo da ovaj uzorak sadrži između 5 i 100 mikrograma proteina na 100 mikrolitara ukupne otopine. Očito je da točna koncentracija nije poznata, ali to su maksimalne i minimalne vrijednosti.
• Pripremite standarde. Nećemo ulaziti u njihove posebnosti zbog kemijskih komplikacija koje oni podrazumijevaju.
• Otopini dodajte 5 mililitara reagensa i ostavite da se inkubira 5 minuta.
• Izmjerite apsorbanciju smjese na spektrofotometru na 595 nm.

Rezultati će se pojaviti na ekranu spektrofotometra, a treba ih zabilježiti stručnjak koji provodi istragu. Jednom kad imaju, potrebno je stvoriti graf (kalibracijsku krivulju) koji se suočava s dvije vrijednosti na svojim osi: apsorbancija u odnosu na mikrograme proteina. Iz krivulje generirane s vrijednostima, one se mogu ekstrapolirati kako bi se dobila točna koncentracija proteina u otopini.

Prednost

Bradfordovu metodu vrlo je jednostavno izvesti za sve koji su povezani s laboratorijskim područjem, budući da se svaki biolog i kemičar tijekom godina studija suočio sa spektrofotometrom, barem s jednim vrijeme. Bilo za mjerenje količine klorofila u otopini uslijed drobljenja lista (tipično) mnogo složenijim stvarima, spektrofotometri su vrlo rašireni u poljima učenje.

Pored svoje lakoće, Treba napomenuti da mnogi proteini u svom prirodnom stanju imaju izuzetno nizak opseg apsorpcije, na 280 nm. Ni svi proteini ne dosežu ovu vrijednost, jer za to moraju imati specifične aminokiseline (tirozin, fenilalanin i triptofan), koje nisu uvijek prisutne. Kako je ova vrijednost apsorpcije u UV području, potreban je poseban stroj koji gotovo nitko ne mora tretirati.

Stvarno, ono što se radi u Bradfordovoj metodi jest "povećanje" vrijednosti apsorpcije bjelančevina vezanjem na boju. Osim što ih je puno lakše čitati u ovom stanju, proteini se odmiču od spektra apsorpcije drugih bioloških molekula, koje bi mogle kontaminirati uzorak.

Nastavi

Na ovom malom satu kemije uronili smo u jednu od najjednostavnijih i najjednostavnijih metoda kvantifikacije proteina, pod uvjetom da je dostupan odgovarajući materijal. U svakom slučaju, moramo naglasiti da, kao i sve u ovom životu, ni on nije savršen i nepogrešiv: obično je potrebno napraviti više razrjeđenja uzorka za analizu (minimalne i maksimalne vrijednosti od 0 µg / ml do 2000 µg / ml), što može dovesti do pogrešaka tijekom postupak.

Nadalje, prisutnost deterdženata i drugih spojeva u otopini može spriječiti ispravan razvoj metode. Srećom, postoje i drugi reagensi koji se mogu dodati u smjesu za rješavanje ovih problema u mnogim slučajevima.

Bibliografske reference:

• Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mehanizam odgovora i interferencije boje u Bradfordovom testu proteina. Analitička biokemija, 151 (2), 369-374.
• Ernst, O. i Zor, T. (2010). Linearizacija Bradfordovog testa proteina. Časopis za vizualizirane eksperimente: JoVE, (38).
• Friedenauer, S. i Berlet, H. H. (1989). Osjetljivost i varijabilnost Bradfordovog ispitivanja proteina u prisutnosti deterdženata. Analitička biokemija, 178 (2), 263-268.
• On, F. (2011). Bradford test proteina. Bio-protokol, e45-e45.
• Jones, C. G., Hare, J. D. i Compton, S. J. (1989). Mjerenje biljnih proteina Bradfordovim testom. Časopis za kemijsku ekologiju, 15 (3), 979-992.
• López, J., Imperial, S., Valderrama, R. i Navarro, S. (1993). Poboljšani Bradfordov test proteina na kolagene. Clinica chimica acta, 220 (1), 91-100.
• Zor, T. i Selinger, Z. (1996). Linearizacija Bradfordovog testa proteina povećava njegovu osjetljivost: teorijske i eksperimentalne studije. Analitička biokemija, 236 (2), 302-308.